[目的]皮肤作为人体最大的器官,极易受到来自外环境的物理、化学以及生物因素损伤。皮肤伤口不仅给患者带来身体上的痛LEE011采购苦,而且给社会带来沉重的经济负担,如何快速修复受损皮肤是一个重要的临床问题。当前常用的治疗手段包括生长因子、组织工程、小分子化合物以及抗生素等,但由于其储存要求高、稳定性差、合成获取困难以及容易造成瘢痕增生等缺点限制了它们的实用性,因此,开发新的皮肤创伤治疗手段、发现新的治疗靶标对干预皮肤损伤修复与再生发展具有一定的研究意义。两栖动物来源活性肽因为其活性强、特异性高、毒副作用小,受到了研究人员的关注,本研究主要对两栖动物来源的天然同源多肽二聚体OA-GL17d的结构、功能和机制进行一定的探索,以期为新型促皮肤创面愈合药物的发展提供新的多肽分子和机制解析。[方法]从野外捕捉成年的云南臭蛙并采集其皮肤分泌物,通过分离纯化并从中鉴定促修复活性多肽,通过质谱、Edman降解、cDNA文库等方法确定该肽的氨基酸序列,然后商业合成了高纯度样品。通过Calcein-AM/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂检测该肽在体外的毒性,通过小鼠腹腔注射方式检测肽在体内的毒性,通过与小鼠红细胞共孵育检测该肽的溶血活性。通过MTS实验检测该肽对人永生化角质形成细胞(HaCaT)的增殖活性,通过细胞划痕实验和Transwell实验检测了其对HaCaT的迁移活性,并检测了多肽对小鼠全皮层损伤皮肤和小鼠烫伤皮肤的促修复效果。为了继续探索促创伤修复的可能机制,我们进行了 HaCaT细胞的miRNA转录组测序分析,选择显著差异表达的miRNA进行结果验证,通过RT-PCR和ELISA检测多肽调控miRNA与靶基因,进而通过MTS和细胞划痕实验进一步检测miRNA在创伤修复中发挥的功能,最后通过蛋白印迹检测多肽以及miRNA对相关信号通路的影响。[结Lysates And Extracts果]1.通过分离纯化我们成功从云南臭蛙的皮肤分泌物中鉴定出了一种新型天然同源多肽二聚体OA-GL17d分子量为4180.74 Da,其单体为GLFKWHPRCGEEQSMWT,两个单体之间以第16位半胱氨酸残基形成的二硫键连接;2.通过序列比对,我们发现“GLFKWHPRCGEEQSMWT”序列与NCBI数据库中报道的多肽没有明显的结构相似性,因此被认为是一个新的多肽,OA-GL17d前体的整体结构与蛙类其他肽类似,包括信号肽、酸性片段、酶切位点“KR”和成熟肽;3.OA-GL17d(0.5 nM、5 nM和50 nM)对HaCaT细胞无细胞毒性,在体外,OA-GL17d在100 μg/mL、500 μg/mL和1 mg/mL剂量下对小鼠红细胞没有明显的溶血活性,而在小鼠腹腔注射100μg/kg、500 μg/kg、1 mg/kg剂量的OA-GL17d也没有造成急性死亡;4.OA-GL17d浓度依赖性促进HaCaT细胞增殖、划痕修复和细胞迁移;5.OA-GL17d显著促进了小鼠全皮层和伤口愈合和小鼠烫伤伤口愈合,通过HE染色发现相比模型组,OA-GL17d加速了伤口再上皮化和肉芽组织的形成;6.HaCaT细胞miRNA转录组测序结果分析显示OA-GL17d显著下调miR-663a的表达,我们通过RT-PCR验证了这个结果;7.通过将miR-663a模拟物和抑制物转染到HaCaT细胞中后,通过RT-PCR发现miR-663a抑制物组显著促进了转化生长因子(TGF-β1)的表达,而miR-663a模拟物组得到了相反的结果,而通过RT-PCR和ELISA结果发现OA-GL17d在HaCaT细胞中显著促进了 TGF-β1的表达;8.通过MTS和细胞划痕实验发现,miR-663a抑制物组显著促进了细胞的增殖和划痕修复,而miR-663a模拟物组得到了相反的结果;9.通过WB实验结果发现,OA-GL17d激活了 Smad信号通路,miR-663a抑制物组也激活了 Smad信号通路,而miR-663a模拟物组则得到了相反的结果。[结论]从云南臭蛙皮肤分泌物中鉴定出一种新型天然同源多肽二聚体OA-GL17d无急性毒性和溶血活性,其促进细胞的迁移和增殖并在HaCaT中通过下调miR-selleck激酶抑制剂663a的表达上调靶基因TGF-β1的表达,激活下游TGF-β1/Smad信号通路,进而加速皮肤伤口的再上皮化和肉芽组织组织的形成。这些结果提示OA-GL17d可能是一种有前景的促进皮肤创伤修复候选药物。更重要的是,这些结果强调了外源性多肽作为分子探针在探索竞争性内源性RNA(ceRNA)机制中的重要性,并提示miR-663a可能是促进皮肤损伤修复的潜在靶点。