研究背景:胰腺癌是一种恶性程度极高、预后极差的消化系统肿瘤,被称做“癌中之王”。在全球范围内其发病率及死亡率呈逐步上升趋势。胰腺癌起病隐匿,缺乏特异的临床表现,且无敏感的早期检测方法,大多数胰腺癌患者在确诊时已处晚期丧失手术机会,只有不足20%的患者符合条件可接受根治性手术治疗,但接受根治性手术的患者术后复发率依然很高,预后很差。除了手术治疗,放、化疗也经常应用于胰腺癌各阶段的治疗,但患者常由于获得性耐药、对放疗不敏感等因素,即使行规范放、化疗,获得的疗效也相当有限,并未大幅改善患者的总体生存时间。免疫治疗、靶向治疗等一些新的治疗方法在胰腺癌中的疗效也并不理想。因此,深入探究胰腺癌发生发展的分子机制,寻找敏感的肿瘤标志物、有效的治疗靶点、耐药的解决方案对于实现胰腺癌的早期诊断、早期治疗、延缓复发以及改善预后具有至关重要的作用。CDK18最初被认为是一种神经元激酶,可磷酸化微管相关蛋白TAU。随着研究的深入,人们发现CDK18可通过多种方式影响细胞的生命活动。例如,CDK18可与细胞周期蛋白A2/E结合,发挥其细胞周期依赖性激酶的作用;CDK18可以促进复制应激信号以及基因组的稳定性;CDK18还可以通过负向调控局部LY2835219使用方法粘着斑激酶的活性进而调节细胞的迁移和粘附。此外,有研究表明CDK18在一些恶性肿瘤中异常表达并影响肿瘤的进展,提示CDK18可能是恶性肿瘤的驱动因素之一,但CDK18在胰腺癌中扮演着什么角色仍然不清楚。我们拟进一步探索CDK18对胰腺癌恶性表型以及吉西他滨化疗敏感性的影响,阐明CDK18在胰腺癌中的作用机制,为发现胰腺癌新的癌基因、寻找新的有效靶点提供理论依据。方法:1构建吉西他滨耐药的胰腺癌人源肿瘤异种移植模型(Patient-derived tumor xenograft,PDX),检测吉西他滨耐药组及对照组中的差异表达基因。通过高通量测序分析两组PDX模型中的差异表达基因情况。通过实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot,WB)、免疫组化实验对两组PDX模型中CDK18的表达情况进行验证。2胰腺癌组织及癌旁组织中CDK18表达的检测。通过q RT-PCR、WB、免疫组化实验对胰腺癌组织及癌旁组织中CDK18的表达进行检测。3胰腺癌细胞和正常胰腺导管上皮细胞中CDK18表达的检测。通过q RT-PCR、WB检测胰腺癌细胞(As PC-1,Capan-1,Bx PC-3,CFPAC-1,PANC-1,MIA Paca-2,Capan-2)和正常胰腺导管上皮细胞(HPDE6-C7)中CDK18的表达差异,并筛选实验用胰腺癌细胞系。4 CDK18的表达与胰腺癌患者的临床病理特征及生存期相关性分析。通过46例胰腺癌标本评估CDK18表达水平与患者年龄、性别、饮酒史、吸烟史、CEA、CA19-9、肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移、远处转移的相关性。采用Kaplan-Meier方法分析CDK18表达水平与胰腺癌患者生存期之间的关系。5检测CDK18对胰腺癌增殖、干性及细胞周期的影响。在体外,通过CCK-8实验、成球实验、细胞周期实验分析差异表达CDK18对胰腺癌细胞增殖、干性及细胞周期的影响,进一步通过q RT-PCR、WB检测差异表达CDK18的胰腺癌细胞中干性相关基因(OCT4,NANOG,Sox2,CD133)的表达。在体内,通过裸鼠成瘤实验分析体内差异表达CDK18对胰腺癌生长情况的影响,进一步通过免疫组化检测差异表达CDK18的胰腺癌移植瘤中增殖标志物(Ki-67)和干性标志物(CD133)的表达。6检测CDK18对胰腺癌吉西他滨化疗敏感性的影响。在体外,通过克隆形成实验、CCK-8实验分析差异表达CDK18对胰腺癌细胞吉西他滨化疗敏感性的影响。在体内,通过裸鼠成瘤实验分析差异表达CDK18对胰腺癌皮下移植瘤的吉西他滨化疗敏感性的影响。7检测ALKBH5对CDK18稳定性的影响。通过RNA甲基化免疫共沉淀q PCR(Me RIP-q PCR)检测胰腺癌细胞(As PC-1,Capan-2)和正常胰腺导管上皮细胞(HPDE6-C7)中CDK18的N6-甲基腺苷(m6A)富集程度,通过q RT-PCR分析46例胰腺癌标本中ALKBH5与CDK18的相关性。通过q RT-PCR、WB、Me RIP-q PCR分析ALKBH5对胰腺癌细胞中CDK18表达及m6A富集程度的影响。通过放线菌素D实验分析ALKBH5对CDK18稳定性的影响。8检测CDK18在胰腺癌中的作用通路。通过高通量测序技术分析由CDK18调控的下游信号通路,并通过WB检测差异表达CDK18的胰腺癌细胞中靶通路相关蛋白表达的情况。结果:1吉西他滨处理组PDX模型中CDK18的表达明显高于生理盐水处理组。通过高通量测序发现CDK18在吉西他滨处理组和生理盐水处理组的PDX模型中差异表达,接着通过q RT-PCR、WB、免疫组化检测吉西他滨组和生理盐水组中CDK18的表达,发现吉西他滨处理组的CDK18表达明显高于生理盐水处理组。2胰腺癌组织中CDK18的表达明显高于癌旁组织。通过q RT-PCR、WB、免疫组化检测胰腺癌组织和癌旁组织中CDK18的表达,发现胰腺癌组织中的CDK18表达明显高于癌旁组织。3胰腺癌细胞中CDK18的表达明显高于正常胰腺导管上皮细胞。通过q RT-PCR、WB检测胰腺癌细胞系和正常胰腺导管上皮细胞系中CDK18的表达,发现胰腺癌细胞系(As PC-1,Capan-1,Bx PC-3,CFPAC-1,PANC-1,MIA Paca-2,Capan-2)中CDK18的表达明显高于正常胰腺导管上皮细胞系(HPDE6-C7)。在7株胰腺癌细胞系中,As PC-1细胞和CFPAC-1细胞的CDK18表达最低,Bx PC-3细胞和Capan-2细胞的CDK18表达最高,选此4株细胞作为实验细胞系。4 CDK18的表达与胰腺癌患者的肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移、远处转移呈正相关,与胰腺癌患者的生存期呈负相关。通过分析46例胰腺癌患者的CDK18表达和患者临床病理特征,发现CDK18表达与胰腺癌患者的肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移以及远处转移呈正相关。通过Kaplan-Meier方法分析CDK18的表达与胰腺癌患者生存期之间的关系,发现CDK18表达与胰腺癌患者的生存期呈负相关。5 CDK18可促进胰腺癌细胞增殖、干性及细胞周期进程。在体外,通过CCK-8实验、成球实验、细胞周期实验分析差异表达CDK18对胰腺癌细胞增殖、干性及细胞周期的影响,发现CDK18可促进胰腺癌细胞的增殖、干性及细胞周期进程,进一步通过q RT-PCR、WB检测差异表达CDK18对胰腺癌细胞中干性相关基因表达的影响,发现CDK18可促进胰腺癌细胞中干性相关基因(OCT4,NANOG,Sox2,CD133)的表达。在体内,通过裸鼠成瘤实验分析体内差异表达CDK18对胰腺癌生长情况的影响,发现CDK18可促进胰腺癌生长,进一步通过免疫组化检测差异表达CDK18对移植瘤中增殖标志物和干性标志物表达的影响,发现CDK18可促进增殖标志物(Ki-67)和干性标志物(CD133)的表达。6 CDK18可降低胰腺癌对吉西他滨化疗的敏感性。在体外和体内,通过克隆形成实验、CCK-8实验、裸鼠成瘤实验分析差异表达CDK18的胰腺癌细胞的吉西他滨化疗敏感性的变化,发现CDK18降低了胰腺癌对吉西他滨化疗的敏感性。7 ALKBH5可降低CDK18的稳定性。通过Me RIP-q PCR检测胰腺癌细胞和正常胰腺导管上皮细胞中CDK18的m6A富集程度,发现胰腺癌细胞(As PC-1,Capan-2)中CDK18的m6A富集程度明显高于正常胰腺导管上皮细胞(HPDE6-C7)。通过q RT-PCR分析46例胰腺癌标本中ALKBH5与CDK18的相关性,发现ALKBH5和CDK18的表达存在显著负相关。通过q RT-PCR、WB、Me RIP-q PCR分析ALKBH5对胰腺癌细胞中CDK18表达及m6A富集程度的影响,发现ALKBH5可降低CDK18的表达及m6A的富集程度。通过放线菌素D实验分析ALKBH5对Ccross-level moderated mediationDK18稳定性的影响,发现ALKBH5可降低CDK18的稳定性。8 CDK18通过Hippo通路在胰腺癌中发挥作用。通过高通量测序技术分析差异表达CDK18的胰腺癌细胞,发现二者的差异表达基因在Hippo通路明显富集。为明确CDK18是否参与调控Hippo通路,通过WB检测差异表达CDK18的胰腺癌细胞中Hippo通路相关蛋白表达情况,发现过表达CDK18使Hippo通路相关蛋白p-LATS2,p-YAP的表达明显下调,抑制CDK18则得到相反结果,进一步验证了CDK18可抑制Hippo通路活性。结论:1 CDK18在胰腺癌中高表达,并与患者肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移、远处转移呈正相关,与胰腺癌患者的生存期呈负相关。2 CDK18可促进胰腺癌细胞增殖、干性及细胞周期进程,降低胰腺癌对吉西他滨化疗的敏感性。3 m6A修饰介导的CDK18在胰腺癌中高表达受ALKBH5调控。4 CDK18通过Hippo通路在胰腺癌获悉更多中发挥作用。