背景:随着肾移植手术技术的不断提高和免疫抑制剂的进步,肾移植短期疗效显著,但长期存活率未见明显改善。近50%的移植肾在术后10年左右出现移植肾功能衰竭进而需要重新恢复血液透析或二次移植治疗。近年来,非免疫因素的肾脏纤维化导致慢性移植肾失功备受关注,也是增加肾移植长期带功存活的难点。肾小管是肾脏重吸收和分泌功能的主要承担者。小管上皮细胞作为肾小管间质固有细胞高度参与肾脏损伤后的修复或纤维化过程。这些细胞主要依靠脂肪酸氧化提供能量。肾脏脂肪酸氧化受损是慢性肾病、癌症和纤维化等多种疾病发展进程中的常见特征。近期研究表明,肾小管上皮细胞中低水平的脂肪酸氧化能力与小管间质纤维化相关。糖酵解增加则会导致乳酸和脂质积累,进而加重酸中毒、组织损伤和纤维化。急性肾损伤和糖尿病肾病中糖酵解中间产物堆积导致有毒终端产物的生成,从而加剧纤维化进展。因此,糖脂代谢稳态对于维持肾脏正常功能至关重要,但其与移植肾纤维化之间的关系尚不明确。靶向恢复糖脂代谢稳态延缓移植肾纤维化进展是否可行以及具体疗效也有待进一步研究。肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)作为一种肿瘤抑制因子,与其最重要的下游靶点AMP依赖的蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK)是葡萄糖和脂肪酸代谢的关键调节枢纽,参与调控细胞极性、细胞周期阻滞、凋亡、能量代谢和造血干细胞维持等多种生物学进程。其信号通路受损导致的糖脂代谢紊乱可能在移植肾纤维化进程中发挥重要作用,但具体机制尚不清楚。目的:首先,验证移植肾纤维化中是否存在糖脂代谢紊乱以及LKB1-AMPK通路调控的糖酵解和脂肪酸氧化与移植肾纤维化之间的关系;其次,进一步明确LKB1-AMPK信号通路参与移植肾纤维化的具体机制;最后,探索靶向LKB1-AMPK信号通路恢复糖脂代谢稳态能否减轻移植肾纤维化并评价其保护肾功能的具体疗效,为延缓移植肾纤维化提供新的治疗策略和理论依据,为临床移植肾失功的防治及增加移植肾长期带功存活提供新的思路。方法:第一部分LKB1-AMPK信号通路受损导致糖脂代谢紊乱促进移植肾纤维化1.构建Brown Norway大鼠肾移植模型并进行移植肾非靶向代谢组学测序,明确纤维化的移植肾中是否存在糖脂代谢紊乱;2.获取临床移植肾穿刺样本的连续切片进行Masson和LKBProtein Tyrosine Kinase抑制剂1、p-AMPK的免疫组化染色,并结合公共数据库的移植肾基因组测序结果分析,明确LKB1-AMPK通路是否与移植肾纤维化程度相关;3.构建敲低LKB1的人肾近端小管上皮细胞HK-2(HK-2-shLKB1)和大鼠肾小管上皮细胞NRK(NRK-shLKB1)的稳转细胞系,并通过油红O和尼罗红染色观察细胞脂肪酸代谢改变,通过检测细胞外酸化率观察糖酵解能力改变情况;4.通过western blot及RT-qPCR技术明确shLKB1对HK-2和NRK细胞胶原分泌和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)重塑的影响;5.通过细胞划痕实验、Transwell细胞迁移实验、鬼笔环肽细胞骨架染色、western blot和RT-qPCR技术明确shLKB1对HK-2和NRK细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响;第二部分LKB1-AMPK信号通路受损导致移植肾纤维化的机制研究1.通过western blot、临床移植肾穿刺样本的连续切片进行Masson和过氧化物酶体增殖物激活受体α(perixisome proliferation-activated receptor alpha,PPARα)的免疫组化染色结果明确LKB1-AMPK-PPARα轴与移植肾纤维化程度的相关性;2.通过油红O、尼罗红染色、细胞ATP含量测定等方法明确应用非诺贝特靶向激活PPARα能否逆转shLKB1导致的脂肪酸代谢紊乱;3.通过western blot、RT-qPCR和细胞免疫荧光技术明确非诺贝特靶向激活PPARα能否逆转LKB1-AMPK-PPARα信号通路受损导致的胶原分泌增加、ECM重塑以及EMT进程;4.临床移植肾穿刺样本的连续切片进行Masson和LKB1、酰基辅酶A氧化酶1(acyl-Co A Oxidase 1,ACOX1)的免疫组化染色,并结合公共数据库的移植肾基因组测序、western blot结果分析,明确脂肪酸β氧化过氧化物酶体途径的LKB1-AMPK-PPARα-ACOX1通路是否与移植肾纤维化程度相关;5.构建敲低ACOX1的HK-2稳转细胞系(HK-2-shACOX1),明确ACOX1与纤维化的相关性;6.通过western blot、RT-qPCR和细胞免疫荧光技术明确过表达ACOX1能否逆转LKB1-AMPK-PPARα-ACOX1信号通路受损导致的胶原分泌增加、ECM重塑以及EMT进程;7.通过对HK-2-shACOX1细胞进行RNA sequence、western blot、RT-qPCR和对临床移植肾穿刺样本的连续切片进行Masson和己糖激酶1(hexokinase 1,HK1)的免疫组化染色,并结合公共数据库移植肾基因组测序结果分析,明确调控糖酵解的LKB1-AMPK-HK1通路是否与移植肾纤维化程度相关;8.通过western blot、RT-qPCR和细胞免疫荧光技术明确应用2-DG抑制糖酵解能否逆转LKB1-AMPK通路受损导致的肾小管上皮细胞胶原分泌增加、ECM重塑以及EMT进程;第三部分药物靶向恢复糖脂代谢稳态抑制移植肾纤维化1.通过western blot、RT-qPCR、油红O染色、尼罗红染色、细胞外酸化率测定、细胞ATP含量测定等方法明确应用A769662靶向激活AMPK能否调控肾小管上皮细胞的糖脂代谢紊乱;2.通过western blot、RT-qPCR和细胞免疫荧光技术明确应用A769662靶向激活AMPK恢复糖脂代谢稳态能否逆转LKB1-AMPK通路受损导致的肾小管上皮细胞胶原分泌增加、ECM重塑以及EMT进程;3.通过PAS染色、ELISA法测定TNF-α/IL-1β/MCP1、免疫组织化学染色及western blot检测IL-6及TNF-α明确应用二甲双胍处理能否减轻移植肾炎症反应;4.构建Brown Norway大鼠肾移植模型并应用非诺贝特、2-DG或二甲双胍处理,验证上述体外实验结果和对肾功能的保护作用。结果:第一部分LKB1-AMPK信号通路受损导致糖脂代谢紊乱促进移植肾纤维化1.Brown Norway大鼠移植肾中糖类化合物减少、脂质积累明显增加,证实发生了糖脂代谢紊乱;2.临床移植肾样本中LKB1和p-AMPK染色阴性区域的纤维化明显增加,公共数据库测序结果也表明LKB1、AMPK转录Laboratory Supplies and Consumables水平与移植肾纤维化程度呈负相关(P<0.05),表明移植肾中存在LKB1-AMPK信号通路受损并与纤维化相关;3.HK-2-shLKB1和NRK-shLKB1细胞中脂质积累和细胞外酸化率明显增加,表明其脂肪酸氧化能力受损的同时糖酵解能力增加;4.shLKB1导致HK-2和NRK细胞Ⅰ、Ⅳ型胶原分泌和ECM重塑相关基因的RNA和蛋白水平均增加;5.shLKB1导致HK-2和NRK细胞迁移能力增加、细胞形态由上皮细胞典型的鹅卵石样转变为纺锤形外观、EMT相关基因的RNA和蛋白水Z-VAD-FMK作用平增加,证实发生了EMT;第二部分LKB1-AMPK信号通路受损导致移植肾纤维化的机制研究1.临床移植肾样本中PPARα染色阴性区域纤维化明显增加以及shLKB1能够导致PPARα表达降低均证实PPARα作为LKB1-AMPK下游参与纤维化进程;2.非诺贝特靶向激活PPARα能够逆转shLKB1导致的细胞脂质积累和ATP含量下降;3.非诺贝特靶向激活PPARα能够逆转LKB1-AMPK-PPARα信号通路受损导致的Ⅰ、Ⅳ型胶原分泌增加、ECM重塑以及EMT进程;4.临床移植肾样本中ACOX1染色阴性区域纤维化明显增加、ACOX1与LKB1高度共定位以及shLKB1导致ACOX1表达降低证实ACOX1作为LKB1-AMPK-PPARα下游参与纤维化进程;5.shACOX1导致肾小管上皮细胞胶原分泌增加、ECM重塑以及EMT;6.过表达ACOX1能够逆转LKB1-AMPK-PPARα-ACOX1信号通路受损导致的胶原分泌增加、ECM重塑以及EMT进程;7.shACOX1后糖酵解相关基因转录水平明显增加,2-DG处理能够明显抑制胶原分泌相关基因的RNA水平;公共数据库分析也表明糖酵解关键酶基因的转录水平与移植肾纤维化程度呈负相关(P<0.05);同时临床移植肾穿刺样本中HK1染色阳性区域纤维化明显增加,这些结果表明LKB1-AMPK通路受损导致的纤维化与糖酵解增加有关;8.应用2-DG抑制糖酵解能够逆转LKB1-AMPK通路受损导致的肾小管上皮细胞Ⅰ、Ⅳ型胶原分泌增加、ECM重塑以及EMT进程;第三部分药物靶向恢复糖脂代谢稳态抑制移植肾纤维化1.应用A769662靶向激活AMPK能够减少细胞脂质沉积、降低细胞外酸化率并增加细胞ATP含量,证实其可以逆转肾小管上皮细胞的糖脂代谢紊乱;2.应用A769662靶向激活AMPK恢复糖脂代谢稳态能够逆转LKB1-AMPK通路受损导致的肾小管上皮细胞Ⅰ、Ⅳ型胶原分泌增加、ECM重塑以及EMT进程;3.二甲双胍处理能够减轻移植肾炎细胞浸润、组织TNF-α/IL-1β/MCP1/IL-6的水平,减轻移植肾炎症反应;4.体内实验证明在接受肾移植的Brown Norway大鼠中应用非诺贝特、2-DG或二甲双胍能够减轻移植肾纤维化并保护肾功能,其中二甲双胍的疗效最为显著。结论:1.纤维化移植肾中存在糖脂代谢紊乱,且与肾小管上皮细胞LKB1-AMPK信号通路受损相关;2.LKB1-AMPK信号通路受损导致肾小管上皮细胞发生EMT进而增加Ⅰ、Ⅳ型胶原分泌和ECM重塑;3.移植肾中主要是PPARα-ACOX1催化的过氧化物酶体途径脂肪酸β-氧化受损以及HK1催化的糖酵解增加导致糖脂代谢异常;4.应用非诺贝特、2-DG和二甲双胍靶向恢复糖脂代谢稳态均能够在一定程度上延缓移植肾纤维化,其中二甲双胍还能减轻炎症反应,对于保护肾功能具有更好的疗效。这些结果为理解移植肾纤维化复杂的分子机制提供了新的视角,为延缓移植肾纤维化增加移植肾带功时长提供了新的治疗策略。