新孢子虫(Neospora caninum)是一种胞内寄生原虫,犬科动物是其终末宿主,牛、羊等动物作为其中间宿主。新孢子虫病呈世界性分布,已有70多个国家报道。新孢子虫感染可造成孕畜流产、产死胎以PLX3397供应商及新生仔畜的神经系统疾病,严重影响我国畜牧业发展。然而目前缺乏防控新孢子虫病的有效疫苗和药物。新孢子虫基因功能缺乏详尽研究,是制约防治新孢子虫病药物和疫苗研发主要原因之一。酪氨酸激酶样蛋白家族在催化活性方面与丝氨酸/苏氨酸激酶家族有共同之处。对疟原虫和弓形虫酪氨酸激酶样蛋白研究发现,与入侵、毒力和免疫反应有关。而新孢子虫酪氨酸激酶样蛋白功能尚不清楚。因此,本研究针对这一问题,通过间接免疫荧光观察新孢子虫酪氨酸激酶样蛋白1(NcTKL1)蛋白亚细胞定位,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建NcTKL1基因敲除虫株(ΔNcTKL1),通过检测ΔNcTKL1虫株的入侵、增殖及致病能力等,分析NcTKL1对新孢子虫的影响,并且进一步探究ΔNcTKL1虫株抗野生虫株感染的免疫保护性作用,以期确定新孢子虫TKL1基因功能以及ΔNcTKL1虫株的免疫保护作用,为新孢子虫病的预防提供候选疫苗。1.新孢子虫酪氨酸激酶样蛋白1表达及亚细胞定位根据新孢子虫NcTKL1的基因序列,原核表达并纯化重组NcTKL1蛋白,免疫BALB/c小鼠后制备抗NcTKL1多克隆抗体,采用间接免疫荧光法对NcTKL1进行虫体亚细胞定位。结果显示,重组NcTKL1蛋白为包涵体表达蛋白,大小为39 k Da;Western Blot结果表明重组蛋白诱导表达成功;抗重组NcTKL1蛋白多克隆抗体效价可达1(25)128 000;NcTKL1蛋白定位于速殖子细胞核。2.新孢子虫酪氨酸激酶样蛋白1基因敲除虫株的构建及功能用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除新孢子虫NcTKL1基因并经PCR、免疫荧光检测等方法对敲除虫株进行鉴定;通过入侵实验、增殖实验、噬斑实验、小鼠毒力实验,以研究NcTKL1基因对新孢子虫入侵、增殖、体外生长及致病性等方面的影响。结果显示,成功构建NcTKL1基因敲除虫株;与野生虫株相比,ΔNcTKL1虫株入侵率(P<0.0001)、增殖率(P<0.001)和噬斑面积显著降低(P<0.0001);野生虫株感染的小鼠在第9d全部死亡而ΔNcTKL1虫株感染的小鼠生存率为100%,野生虫株感染小鼠体重持续下降而ΔNcTKL1虫株感染的小鼠体重波动较小;感染ΔNcTKL1虫株的小鼠血清中IL-6(P<0.01)、TNF-α(P<0.01)、IFN-γ显著降低(P<0.05),而IL-12变化不显著;荧光定量PCR结果显示,与野生虫株相比,感染ΔNcTKL1虫株的小鼠心、肾、肝、脾、肺组织荷虫量显著降低(P<0.05),脑组织荷虫量差异不显著;ΔNcTKL1虫株引起的小鼠心、肝、脾、肺、肾和脑部病变程度较轻。3.新孢子虫酪氨酸激酶样蛋白1基因敲除虫株抗野生虫株保护效果ΔNcTKL1虫株免疫C57BL/6小鼠后,分别在不同时间第10d、20d、30d、40d攻虫,通过检Bafilomycin A1说明书测细胞因子变化、组织器官荷虫量及生存率评价敲除虫株对小鼠抗野生虫株感染的免疫保护作用,野生虫株感染组和正常鼠为对照组。结果显示,与野生株对照组相比,ΔNcTKL1免疫第10d组小鼠血清IL-6、IFN-γ分泌量显著下降(P<0.05),IL-12、TNF-α分泌量显著上升(P<0.001);第20d组小鼠血清IFN-γ分泌量显著下降(P<0.0001),IL-12、TNF-α分泌量显著上升(P<0.05);第30d组小鼠与免疫后第40d组小鼠血清IFN-γ分泌量均显著下降(P<0.001),IL-12分泌量均显著上升(P<0.0001)。ΔNcTKL1虫株免疫后第10d攻虫小鼠生存率为100%。荧光定量PCR结果显示,免疫第10d攻虫小鼠心、肝、脾、肺、肾和脑组织荷虫量显著降低(P<0.05);病理切片观察发现小鼠心、肝、脾、肺、肾和脑病理损伤程度最轻。而第20d至第40d攻虫小鼠生存率逐渐下降,虫体数量和病变较重。上述结果表明ΔNcTKL1虫株能够有效激活小鼠免疫反应,免疫10d后对野生虫株感染有较好的免疫保护作用。综上所述,NcTKL1蛋白定位于新孢子虫速殖子细胞核;成功构建ΔNcTKLfood as medicine1虫株;ΔNcTKL1虫株与野生虫株相比入侵、增殖、体外生长及致病性均下降;ΔNcTKL1虫株免疫后第10d对小鼠感染野生虫株起到较好的免疫保护作用。ΔNcTKL1虫株可作为新孢子虫疫苗的候选。