背景:骨质疏松症(Osteoporosbioartificial organsis,OP)是一种常见的骨代谢疾病,以骨强度下降和骨折风险增加为主要特征,已成为全球性的公共健康问题。氧化应激是指生物体内氧化与抗氧化防御系统失衡,倾向于促氧化状态,可对细胞造成氧化损伤。氧化应激可通过促进骨吸收和抑制骨形成破坏骨重建平衡,进而导致骨质疏松症的发生。传统氧化应激标记物中的丙二醛(malondialdehyde,MDA)、8-羟基鸟苷(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine,8-OHd G)、戊糖素(pentosidine,PTD)和硝基酪氨酸(nitrotyrosine,NT)分别反映单一脂质、DNA、糖类和蛋白质的氧化损伤情况。但其检测方法变异系数大、敏感性和特异性低。荧光氧化产物(Fluorescent Oxidation Products,Fl OPs)是一类新型的氧化应激标记物,能综合反映脂类、蛋白质、DNA和碳水化合物的氧化损伤情况。但现有Fl OPs检测方法的可靠性低,其敏感性、特异性以及影响Fl OPs检测稳定性的实验室因素还不太确定。近二十年来,Fl OPs被广泛应用于慢性病流行病学研究中,与心血管疾病、肾脏疾病和癌症等氧化应激相关疾病的发生和发展密切相关。然而,Fl OPs与骨质疏松症、骨微结构和骨转换标志物的关系尚不明确。目的:1.采用荧光微孔板技术改善现有Fl OPs检测方法的可靠性,并对其敏感性、特异性和实验室检测的稳定性进行探讨。2.通过人群研究明确改进检测方法后的Fl OPs与骨质疏松症的关联。3.通过氧化应激动物模型进一步探讨Fl OPs与骨微结构和骨转换标志物的关联。方法:1.Fl OPs检测方法的可靠性、敏感性和特异性研究(1)人群研究:采集16名健康志愿者和8名心血管疾病患者的外周血,因不同波长下检测的Fl OPs反映的氧化产物不同,我们采用荧光微孔板技术检测了3个波段的血浆Fl OPs水平(包括Fl OP＿320:激发/发射波长为320/420 nm,Fl OP＿360:激发/发射波长为360/420 nCL 318952研究购买m和Fl OP＿400:激发/发射波长为400/475 nm)。分析不同血浆/萃取剂比例下Fl OPs检测的变异系数(coefficients of variation,CV),确定最优的血浆/萃取剂比例。通过系列实验探讨Fl OPs检测是否受溶血、血液标本运送时间、标本储存和冻融等实验室因素的影响。(2)动物研究:构建D-半乳糖诱导的氧化应激动物模型,分析Fl OPs和传统氧化应激标记物(MDA、8-OHd G、PTD和NT)与D-半乳糖剂量的相关系数,以检验Fl OPs在反映氧化损伤方面的敏感性。由于氧化应激与炎症的发生过程经常同步,因此我们又检验了Fl OPs与炎症因子C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)的关联,以明确Fl OPs是否为特异性的氧化应激指标。2.Fl OPs与骨质疏松症的关联研究共设计了三个人群研究,如下:(1)采用横断面研究设计,研究对象来自2019年于吉林省某三甲医院健康体检人员;使用双能X射线吸收(dual-energy X-ray absorptiometry,DXA)仪测量参与者的髋部骨密度(bone mineral density,BMD)。使用多元线性回归分析Fl OPs与髋关节BMD的关联。为了比较Fl OPs是否比传统氧化应激指标更为灵敏地检验骨健康情况,我们还分析了MDA与BMD的关联。(2)采用横断面研究设计,以社区中老年人为研究对象,使用定量超声骨密度仪测量参与者的跟骨骨密度。使用多元线性回归分析Fl OPs与超声BMD的关联。超声声速(speed of sound,SOS)和宽带超声衰减(broadband ultrasound attenuation,BUA)是反映超声BMD的两个重要参数。(3)采用病例对照研究设计,研究对象来自吉林省两所三级甲等医院就诊人员,按照性别、年龄、医院和样本类型进行1:2匹配。骨质疏松症病例和对照均通过DXA检测的BMD确定。使用多元条件logistic回归模型分析Fl OPs与骨质疏松症的关联,计算比值比(odds ratio,OR)和95%置信区间(confidence intervals,CI)。3.Fl OPs与骨微结构和骨转换标志物的关联研究选用8周龄的雄性Wistar大鼠,随机分成D-半乳糖组和对照组(注射0.9%的生理盐水),每组各8只。在实验的第0、30和60天进行尾静脉采血,第90天将动物麻醉后处死,收集股骨和血液样本。检测各时间点血浆Fl OPs、NT、MDA、8-OHd G、PTD和血清骨转换标志物[1型胶原交联氨基端延长肽(N-terminal lengthening peptide of type 1 collagen,P1NP和1型胶原交联羧基末端肽(C-terminal telopeptide of type I collagen(CTX)]的水平。使用显微CT(micro-CT)对大鼠股骨进行扫描,分析骨微结构相关指标。采用t检验比较90天时对照组和D-半乳糖组大鼠松质骨形态计量学参数的差异。采用双因素重复测量方差分析评估大鼠Fl OPs、NT、MDA、8-OHd G、PTD、P1NP和CTX水平是否存在组间趋势差异和组内随时间变化的差异。结果:1.Fl OPs检测方法的可靠性、敏感性和特异性研究(1)人群研究当血浆/萃取剂的比例为1:20时,Fl OPs检测的CV值最小。健康人群组Fl OPs检测的批次间CV<3.6%,批次内CV<2.7%;冠心病组Fl OPs检测的批次间CV<4.4%,批次内CV<2.0%。(2)动物研究动物实验结果显示,30天时,Fl OP＿320和Fl OP＿360与D-半乳糖剂量的相关系数分别为0.816和0.801,这些相关系数是MDA(r=0.183)、8-OHd G(r=0.157)、PTD(r=0.254)和NT(r=0.068)的3-12倍。Fl OP＿360与CRP存在显著相关(r=0.225,P=0.045),而Fl OP＿320和Fl OP＿400与CRP的相关性均无统计学意义。短期和严重溶血会影响Fl OPs检测水平,而短期标本运送时间<12 h、-80℃条件保存一年、冻融次数≤5次均不会明显影响Fl OPs检测水平。2.Fl OPs与骨质疏松症的关联研究(1)Fl OPs与髋关节BMD的关联性分析共纳入164名男性,平均年龄为56.6±2.0岁。调整混杂因素后,Fl OP＿320水平每增加一个标准差,股骨颈和全髋BMD分别降低0.014 g/cwww.selleck.cn/products/CP-690550m~2、0.016g/cm~2。Fl OP＿360和Fl OP＿400水平每增加一个标准差,全髋BMD分别降低0.017 g/cm~2和0.019 g/cm~2。MDA与股骨颈和全髋BMD无显著统计学关联。(2)Fl OPs与超声BMD的关联性分析共纳入491名研究对象,平均年龄为65.2±9.7岁。其中女性290名(占59.1%)。调整混杂因素后,Fl OP＿320与SOS呈负相关(βfor per 1-SD increase=-2.562;P=0.018),Fl OP＿360和Fl OP＿400与SOS的关联无统计学意义。未发现Fl OPs与BUA之间的统计学关联。(3)Fl OPs与骨质疏松症的关联性分析共纳入87名骨质疏松症病例和174名对照。调整混杂因素后,Fl OP＿320每增加一个标准差,骨质疏松症患病风险增加49%(OR=1.49,95%CI:1.01-2.20)。血清中Fl OP＿360水平每增加一个标准差,骨质疏松症患病风险增加59%(OR=1.59,95%CI:1.07-2.37)。Fl OP＿400与骨质疏松症的关联无统计学意义。3.Fl OPs与骨微结构和骨转换标志物的关联研究与对照组相比,D-半乳糖组大鼠Fl OP＿320和MDA水平升高,血清P1NP水平降低(all P<0.05)。大鼠血浆Fl OPs水平与MDA、8-OHd G等传统氧化应激标记物随时间(0～90天)的总体变化趋势基本一致。Micro-CT扫描结果显示,与对照组相比,D-半乳糖实验组大鼠骨体积分数(0.07±0.03 vs.0.13±0.05;P=0.008)和体积骨密度(225.4±13.8 vs.279.1±33.2 mg HA/cm~3;P=0.001)显著降低,骨小梁的微结构也受到了破坏。结论:1.基于荧光微孔板技术检测的Fl OP＿320、Fl OP＿360和Fl OP＿400具有高度可靠性和稳定性;Fl OP＿320在评估体内氧化应激水平方面具有较高的敏感性和特异性。2.Fl OP＿320、Fl OP＿360和Fl OP＿400与全髋BMD呈显著负相关,Fl OP＿320与股骨颈BMD和SOS呈显著负相关,而MDA与BMD之间无统计学关联。这提示,在评估氧化应激与骨健康的关联时,Fl OPs可能比MDA更为敏感。3.Fl OP＿320和Fl OP＿360水平与骨质疏松症患病风险呈显著正相关。4.Fl OP＿320水平升高与骨微结构破坏和骨形成标志物水平下降存在关联。