背景:胰腺导管腺癌是一种高度恶性肿瘤,其五年生存率约为8%。手术切除联合全身化疗目前仍是胰腺癌唯一有效的根治方式,然而仅有约10%的患者具有手术机会。因此,寻找其他有效的治疗方案是胰腺癌中急需解决的问题。基于抗PD1(Programmed cell death-1,程序性死亡受体-1)/PD-L1(Programmed cell death ligand-1,程序性死亡受体-配体1)轴的免疫治疗可以显著改善多种晚期肿瘤的预后,例如非小细胞肺癌,肾细胞癌以及恶性黑色素瘤等,然而其在胰腺导管腺癌中的效果不尽如人意。为了进一步了解PD1轴在胰腺癌中的临床意义,我们分析了 PD1的两个配体 PD-L1/PD-L2(Programmed cell death ligand-2,程序性死亡受体-配体 2)与临床病理特征、免疫浸润细胞及几个重要的DNA损伤应答分子之间的关系,并探索了它们在胰腺癌中的预后意义。方法:(1)首先,我们通过免疫组织化学染色检测了 291例手术切除的原发性胰腺导管腺癌石蜡包埋组织中PD-L1和PD-L2的表达,并分别对肿瘤细胞上和间质免疫细胞上的染色进行评估;(2)随后,卡方检验用于分析PD-L1和PD-L2与临床病理特征、肿瘤间质中的免疫浸润细胞以及肿瘤细胞中DNA损伤应答分子之间的相关性;(3)此外,我们运用COX回归风险模型(Enter法)进行单因素和多因素分析以探索PD-L1和PD-L2的表达在胰腺癌中的预后意义;(4)最后,我们也分析了 PD-L1和PD-L2对术后辅助化疗的影响。结果:(1)PD-L1和PD-L2在胰腺癌肿瘤细胞上表达的阳性率分别为30%(80/264)和40%(100/255),而二者在间质中免疫细胞上的阳性表达率均为20%(54/264,50/255);(2)PD-L1在肿瘤细胞上的表达与其在免疫细胞上的表达呈显著正相关(p<0.0001),PD-L2的表达也呈现同样的结果;然而PD-L1与PD-L2之间不存在相关性,其中61例样本表现为PD-L2单阳性,38例样本表现为PD-L1单阳性,34例样本表现为PD-L1和PD-L2共表达;(3)此外,相关性分析结果显示PD-L1在肿瘤细胞上的表达与几个临床病理特征相关,比如肿瘤淋巴结分期N1期(p=0.011)和AJCC分期Ⅱ期(p=0.002),而与免疫浸润细胞无关;与之相反的是,PD-L1在免疫细胞上的表达与多种T淋巴细胞浸润相关,包括CD3+(p=0.007)、CD4+(p=0.023)、CD8+(p=0.043)、FOXP3+(p<0.0001)以及 CD45RO+(p=0.014)T细胞;(4)PD-L2在肿瘤细胞上的表达与FOXP3+调节T细胞浸润(p=0.001)以及BRCA2高表达(p<0.0001)呈显著正相关,而PD-L2在免疫细胞上的表达仅与Foxp3(p=0.015)相关;(5)生存分析表明 PD-L1[风险比(hazard ratio,HR)1.403,95%置信区间(confidence interval,CI):1.010-2.055,p=0.046]和 PD-L2(HR 1.476,95%CI:1.042-2.091,p=0.028)在肿瘤细胞上的阳性表达是胰腺癌不良疾病特异生存期的独立风险因素;此外,亚组分析表明肿瘤细胞上PD-L2的阳性表达在淋巴结阴性组(p=0.023)、肿瘤中高分化组(p=0.004)、BRCA1低表达组(p=0.017)、p53正常表达组(p=0.034)以及错配修复正常组(p=0.004)等亚组中是不良预后的独立风险因素;(6)最后,生存分析表明无论肿瘤细胞是否表达PD-L1和PD-L2,术后辅助化疗均可以显著影响患者预后,而免疫细胞上PD-L1和PD-L2 阳性表达的病例中,术后辅助化疗对患者生存无影响。结论:(1)PD-L1和PD-L2可以作为胰腺癌预后的预测指标;(2)胰腺癌中PD-L1和PD-L2的表达与T淋巴细胞浸润之间存在潜在的关联;(3)BRCA2的表达与PD-L2之间存在显著正相关,推测同源重组修复通路可能调节胰腺癌中PD-L2的表达;(4)PD-L2或许可以和BRCA1、p53以及错配修复蛋白等DNA损伤应答分子一起共同用于构建胰腺癌风险模型;(5)PD-L1和PD-L2在免疫细胞上的表达可能具有预测胰腺癌术后辅PF-02341066助化疗效果的作用。背景:PALB2(Partner And Localizer Of BRCA2)最初被发现可募集及定位BRCA2至细胞核中,并增强BRCA2在核中的稳定性。后续研究证明双等位基因PALB2缺失可导致范可尼贫血的发生,且该种类型的范可尼贫血与BRCA2缺失Bioluminescence control引起的亚型具有相似的临床和细胞学特征。此外,PALB2也是同源重组修复通路的主要参与者,一直被认为是乳腺癌和胰腺癌的风险基因。目前Clinvar数据库中记载了多种肿瘤中发现的上千个PALB2的突变,其中的绝大多数为意义未明的错义变异。基于细胞实验的功能表征对明确这些变异的临床意义具有重要的支持作用。然而,目前尚未有关于家族性胰腺癌中PALB2突变体的功能研究,甚至在所有肿瘤中PALB2突变体被报道的都较少。方法:本研究中,我们通过靶向测序在一个家族性胰腺癌登记中心的54名胰腺癌患者中发现了两个新的PALB2胚系错义突变,分别为c.191C>T和c.311C>T,这两个突变分别编码 p.Ser64Leu(S64L)和 p.Pro104Leu(P104L)突变体。基于 PALB2的生物学功能,我们通过以下实验检测了突变体S64L和P104L对DNA损伤应答的影响:(1)首先,在缺乏内源性PALB2表达的EUFA1341中通过逆转录病毒载体稳定表达野生型PALB2及S64L和P104L变异型PALB2,并使用免疫共沉淀检测SVE-822配制64L和P104L变异对PALB2与其N端结合蛋白之间相互作用的影响;(2)其次,通过免疫荧光检测用野生型PALB2及S64L和P104L变异型PALB2重组的EUFA1341细胞中PALB2及其下游分子RAD51在细胞核中的募集;(3)随后,通过DNA双链断裂起始的同源重组实验在含GFP报告基因的U2OS-DR细胞中检测PALB2的S64L和P104L变异对细胞同源重组活性的影响;(4)最后,通过集落形成实验检测PALB2的S64L和P104L变异对EUFA1341细胞对电离辐射(ionizing radiation,IR)和 PARP(poly ADP-ribose polymerase,聚腺苷二磷酸核糖聚合酶)抑制剂的敏感性的影响。结果:(1)免疫共沉淀结果显示,与野生型PALB2相比,S64L和P104L变异型PALB2与其N端结合蛋白包括BRCA1、KEAP1、RAD51及RAD51AP1的相互作用未发现明显减弱;(2)对EUFA1341细胞核中PALB2及RAD51的募集灶定量分析显示,与野生型PALB2相比,S64L和P104L变异型PALB2对其自身以及下游重组酶RAD51在DNA损伤处的募集水平显著降低;(3)S64L和P104L均可以很大程度的减少细胞系中的DNA双链断裂引起的同源重组修复通路的活性,且二者的活性介于野生型PALB2和空载体之间;(4)这两种变异均可以导致EUFA1341细胞对IR和PARP抑制剂的敏感性增高。结论:我们的结果首次确定了与家族性胰腺癌相关的功能性有害的位于已知功能区域以外的PALB2 N端错义变异。由于这两种变异可损害细胞的DNA损伤应答,因此可能会增加癌症发生的风险。此外,我们的结果支持使用电离辐射或PARP抑制剂对携带有害PALB2变异的胰腺癌和其他肿瘤进行个性化治疗的可能性。