研究背景及目的:肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是起源于肾小管上皮的肾脏原发性恶性肿瘤。全世界每年约有40万人患有肾癌,其中17.5万人死于这种疾病。肾癌约占所有癌症的2%～3%,是泌尿系统肿瘤中致死率最高的类型。肾透明细胞癌(cc RCC)是RCC的主要亚型,是最thyroid cytopathology常见的肾细胞癌,也是RCC死亡病例中的主要类型。由于其转移率高、诊断不易,使得预后不良的成为肾细胞癌的典型特征。RCC的发病机制复杂,大约三分之一的RCC患者在局部晚期或转移性肿瘤的表现期间才被诊断出来,导致临床治疗效果欠佳。这大大降低了他们的总体生存率。因此,深入了解肾细胞癌的发生和转移机制,有助于为肾细胞癌的治疗提供新的思路。环状RNA(circ RNA)作为非编码RNA,在人类癌症中发挥着不可或缺的作用。越来越多的研究表明,circ RNAs在癌症的发生和发展中发挥着关键作用,并可能作为癌症生物标志物和新的治疗靶点发挥作用。RCC中普遍存在异常的circ RNA,发挥致癌或抑制作用,调节细胞功能。特别是,失调的circ RNA与RCC患者的临床病理学特征、预后和生存相关,表明这些稳定的circ RNA可以成为癌症诊断和预后的潜在的生物标志物。更重要的是,circ RNA在与RCC癌变和进展相关的各种信号通路的上游发挥着至关重要的调节作用,这使其成为RCC的有吸引力的治疗靶点。此外,miRNA的分子靶向治疗有望为肿瘤治疗开辟新的方向,越来越多的证据表明,由circ RNA的海绵效应引起的miRNA失调可能对癌症的进展非常重更多要。在以往的文献资料及研究中,我们发现circ＿0008717在RCC细胞系中表达水平上调,但是尚未有研究对其下游通路做进一步验证。在本研究之初,我们通过生物信息库circinteractome和Starbase预测circ＿0008717海绵作用的miR-217,并证实其相互作用。另一方面,在公共数据库基因表达谱交互分析(GEPIA)中我们发现FBXO17在RCC肿瘤组织中高度表达,且相关RNA水平上,hsa＿miR-217和has＿FBXO17 3’非翻译区(3’UTR)之间存在一个特殊的结合位点。作为F-box蛋白中最大的亚家族,FBXO有37个成员,许多研究证实其中许多成员与肿瘤生物学过程密切相关。F-box蛋白17(FBXO17)是F-box蛋白家族的成员,已被证明在不同类型的癌症中受到异常调节,之前的研究表明FBXO17作为癌基因发挥作用,促进胶质瘤和肺的发展腺癌。然而,FBXO17和相关机制在RCC中的潜在作用仍未完全了解。因此,我们推测是否存在circ＿0008717/miR-217/FBXO17信号通路影响RCC的进展,并设计以下研究,在体内和体外水平探究miR-217与circ＿0008717或FBXO17之间的相互作用及其在肾癌生物学中的作用。研究方法:1、验证circ＿0008717在肾细胞癌中的作用:首先收集临床组织以观察circ＿0008717的表达。之后,使用RNase R和放线菌素D鉴定circ＿0008717的循环性和稳定性。接下来,将sh-circ＿0008717转染到769P和A498细胞中,以及采用CCK-8测定和Ed U检测、Transwell迁移和侵袭以及流式细胞仪检测转染sh-circ＿0008717的769P和A498细胞的增殖、迁移和转移以及凋亡率的影响。2、探索circ＿0008717在肾细胞癌中的作用机制:首先通过生物信息学分析,得出miR-217是circ＿0008717的假定靶点的结论;接着,运用双荧光素酶报告分析、生物素下拉分析以及RIP分析探究miR-217是否是circ＿0008717的靶标。随后,在769P和A498细胞生物学行为中进一步确定circ＿0008717和miR-217之间的相互作用。采用CCK-8分析、Ed U分析、流式细胞术分析以及Transwell分析探究被circ＿0008717基因敲低阻断的细胞增殖、凋亡情况,以及转染sh-circ＿0008717的细胞的迁移和侵袭能力的影响。3、验证circ＿0008717、FBXO17和miR-217三者之间的关系:通过公共数据库基因表达谱交互分析(GEPIA)探究FBXO17在RCC肿瘤组织中与正常组织相比表达的变化。对临床组织样本进行了以下分析:IHC染色分析和q RT-PCR分析检测临床肿瘤组织与正常组织相比较FBXO17的丰度和在m RNA水平上的表达量变化。接着,通过对生物信息学网站star Base的分析,发现了在hsa＿miR-217和has＿FBXO17 3’非翻译区(3’UTR)之间存在一个特殊的结合位点,然后产生了FBXO17 3’UTR的突变序列片段双荧光素酶报告基因测定。接着上述实验结果,探索了FBXO17过度表达对circ＿0008717以及miR-217的影响。随后,进行CCK-8和Ed U检测以及流式细胞术检测细胞增殖、凋亡以及迁移能力,检测转染sh-circ＿0008717或miR-217的细胞中葡萄糖摄取和乳酸产生水平变化。接着,用oe-circ＿0008717或oe-circ＿0008717+miR-217、oe-NC或oe-circ＿0008717+miR-NC作为相应的对照转染。接下来,尝试建立异种移植模型来探索circ＿0008717在体内的作用,以及我们试图了解在circ＿0008717过表达的肿瘤组织中HK2和GLUT1的表达是否有变化。研究结果:1、Circ＿0008717可以促进RCC细胞的迁移和侵袭,在RCC的发展中起着致癌作用临床组织分析数据显示,与周围正常组织相比,肿瘤组织中circ＿0008717的表达显著增加。与HK-2、DI-HEK293和HKb20细胞相比,circ＿0008717在RCC细胞系中的表达显著增加。这些研究结果表明circ＿0008717在RCC中异常上调。通过RNase R和放线菌素D检测,结果显示circ＿0008717比其线性对应物更稳定。将sh-circ＿0008717转染到769P和A498细胞中。结果显示,细胞中circ＿0008717的表达明显降低。CCK-8测定显示,用sh-circ＿0008717转染的769P和A498细胞的细胞增殖能力明显受阻。Ed U检测显示circ＿0008717敲低减少了Ed U阳性细胞的数量。流式细胞仪检测显示,转染sh-circ＿0008717的769P和A498细胞的凋亡率显著增加。Transwell迁移和侵袭分析表明,沉默circ＿0008717也显著削弱了细胞迁移和侵袭能力。此外,我们发现沉默circ＿0008717显著降低了葡萄糖摄取和乳酸产生的水平。而circ＿0008717过表达表现出相反的作用,导致细胞增殖、迁移、侵袭和糖酵解的促进,细胞凋亡的减少。这些发现表明,circ＿0008717在RCC细胞的发育过程中发挥了致癌作用。2、circ＿0008717基因敲低通过富集miR-217抑制RCC细胞的恶性行为利用生物信息学工具分析后,我们推测miR-217是circ＿0008717的潜在靶点;接着,双荧光素酶报告分析显示,在转染了WT-circ＿0008717但未转染MUT-circ＿0008717的769P和A498细胞中,重新引入miR-217显著降低了荧光素酶活性;然后,生物素下拉分析表明,相对于Bio NC,Bio miR-217可以捕获大量circ＿0008717;RIP分析表明,相对于抗Ig G组,抗Ago2 RIP组中circ＿0008717和miR-217均显著表达RIP组;以及miR-217在肿瘤组织中的表达明显低于正常组织。以上所有证据都表明miR-217是circ＿0008717的靶标。来自CCK-8分析和Ed U分析的数据表明,细胞增殖被circ＿0008717基因敲低阻断,但被miR-217抑制部分恢复;流式细胞术分析表明,circ＿0008717敲低诱导的细胞凋亡被miR-217缺陷部分减弱;Transwell分析表明,转染sh-circ＿0008717的细胞的迁移和侵袭能力受到抑制,但转染sh＿circ＿0008717+抗miR-217的细胞的迁移和侵袭能力恢复;此外,受circ＿0008717基因敲低抑制的葡萄糖摄取和乳酸产生在很大程度上被miR-217下调增强。3、Circ＿0008717通过靶向miR-217/FBXO17轴促进体内肿瘤发生和肿瘤生长,促进RCC的进展GEPIA发现FBXO17在RCC肿瘤组织中与正常组织相比高度表达。我们对临床组织样本进行分析,结果表明:临床肿瘤组织中FBXO17的丰度高于正常组织,且在m RNA水平上的表达也升高。我们发现了在hsa＿miR-217和has＿FBXO17 3’非翻译区(3’UTR)之间存在一个特殊的结合位点,然后荧光素酶活性的结果显示,与miR-NC相比,转染miR-217的769P和A498细胞中FBXO17蛋白的表达显著下降。上述数据表明miR-217与FBXO17结合并抑制FBXO17表达。我们发现在转染sh-circ＿0008717或miR-217后769P和A498细胞中FBXO17蛋白的表达显著降低。CCK-8和Ed U检测的数据表明,细胞增殖能力在转染sh-circ＿0008717或miR-217的769P和A498细胞中显著抑制,以及流式细胞术结果表明,circ＿0008717敲低或miR-217富集会加速细胞凋亡,但会因FBXO17过表达而缓解。我们还发现,转染sh-circ＿0008717或miR-217的细胞中葡萄糖摄取和乳酸产生水平显著受损,且抑制HK2和GLUT1蛋白的表达。这些结果都表明FBXO17重新引入改善了由circ＿0008717敲低或miR-217富集引起的影响。circ＿0008717敲低显著限制了肿瘤体积和肿瘤重量,此外,我们还发现circ＿0008717在circ＿0008717组小鼠肿瘤组织中的表达明显高于载体组,与sh-NC组相比,sh-circ＿0008717组的circ＿0008717表达显著降低。对比之后得出,miR-217在circ＿0008717组的肿瘤组织中的表达显著降低,而在sh-circ＿0008717组的肿瘤组织中其表达升高。毫无疑问,FBXO17表达在circ＿0008717组的肿瘤组织中也有所增强,但在sh-circ＿0008717组的肿瘤组织中表达减弱。此外,IHC检测的数据显示,在circ＿0008717缺失的肿瘤组织中,MMP9的丰度大大降低,提示circ＿0008717通过靶向miR-217/FBXO17轴促进体内肿瘤发生和肿瘤生长。研究结论:(1)Circ＿0008717在肾细胞癌组织和细胞中异常上调,表达水平与肾细胞癌的进展正相关。(2)基于体外细胞学实验和异种移植模型实验的结果:circ＿0008717促进肾癌的增殖、迁移/侵袭能力,抑制肾癌细胞的凋亡,增强其葡萄糖摄取能力和乳酸购买E-616452产生水平,以及糖酵解能力。(3)Circ＿0008717作为ce RNA,可海绵作用于miR-217,减少其对FBXO17表达的抑制作用,从而促进肾细胞癌的进展。