结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是全球范围内第三大最常见的恶性肿瘤,严重威胁人类健康。目前已有部分小分子药物被批准用于治疗结直肠癌,但是这些小分子化合物存在药效低、靶向性差和耐药性强等问题。因此,研发新的治疗策略和作用靶点以开发新的CRC治疗药物迫在眉睫。Wnt/β-catenin信号通路的异常与许多癌症相关包括结直肠癌,因此Wnt信号是一个很有前景的药物开发靶点。我们利用本实验室天然化合物库通过对抑制Wnt信号传导和CRC细胞增殖的检测筛选并鉴定出一类新型查尔酮衍生物家族(CXs)。本课题通过对PLX-4720体内实验剂量CX258进行进一步的体外和体内研究,以Receiving medical therapy探讨其在结直肠癌的作用效果及相关分子机制。本课题的研究结果为结肠癌的治疗提供了潜在的候选药物和新的治疗思路。实验方法及结果如下:1.化学法合成了查尔酮衍生物CX258,利用~1H-NMR、~(13)C-NMR、HRMS和HPLC分析了目标化合物的结构和纯度。细胞水平活性验证表明CX258抑制结肠癌细胞的增殖,并确定其对四种结肠癌细胞株的IC_(50)值。Western blot和Wnt报告基因检测实验证实了CX258在转录水平抑制Wnt信号通路及其下游靶基因Axin2和c-Myc的表达。2.通过RNA-Seq分析CX258处理前后,结肠癌细胞株LS174T转录组差异基因表达变化。综合差异显著性排序、Degree Scores排序、通路富集分析以及文献背景知识,筛选出5个枢纽基因,分别是RRM2、TOP2A、UBE2C、CDK1和AURKB。q RT-PCR验证LS174T和DLD-1细胞中五个枢纽基因在CX258处理后表达降低,与RNA-seq结果相一致。通过GEPIA程序分析了TCGA数据库,在CRC中,这五种基因的表达水平明显升高。蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析结果显示这五种基因间存在相互作用关系。本课题主要对差异基因显著性排名第一的TOP2A和Degree Score排名第一的CDK1进行了深入研究。3.Western blot检测CX258可显著抑制TOP2A的表达且TOP2A表达的降低可抑制CDK1的表达。此外,TOP2A表达的降低可削弱CX258对结肠癌细胞增殖的抑制作用、细胞周期的阻滞作用以及对Wnt靶基因的抑制作用。这些结果表明TOP2A可能是CX258调节Wnt/β-catenn信号通路,抑制结直肠癌细胞增殖和周期进展的潜在调节因子。4.成功建立NOD/SCID小鼠结肠癌移植瘤模型,并明确了CX258的体内抑瘤能力:CX258给药后显著抑制了肿瘤的生长且在15天内未观察到明显的毒性。Western blot、HE染色和免疫组织化学染色进一步验证了在CX258处理的肿瘤组织中,影响细胞周期的P53和P21显著激活但CDK1的表达被抑制,此外,细胞增殖标志物Ki-67,TOP2A和Wnt靶基因在CBelumosudil试剂X258处理的肿瘤标本中表达显著降低。结论:查尔酮衍生物CX258抑制CDK1的表达,诱导CRC细胞周期阻滞在G2/M期,进而抑制结直肠癌细胞的增殖,其作用机制可能是通过抑制TOP2A的表达来抑制Wnt/β-catenin介导的信号通路下游靶基因的表达。以上结果可以说明CX258是TOP2A/Wnt/β-catenin信号通路潜在的新型抑制剂。TOP2A是Wnt信号通路和细胞周期调节的潜在中介物,这可能为结直肠癌的治疗带来新的治疗策略和靶向药物。