1目的从竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ce RNA)角度,探讨lnc RNA LINC00638竞争性结合miR-3184-5p调控SOD2,介导类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)炎症反应和氧化应激的机制及新风胶囊(xinfeng capsule,XFC)的干预作用。2方法2.1研究一LINC00638/miR-3184-5p/SOD2组合介导RA成纤维样滑膜细胞炎症反应和氧化应激的机制本研究以RA患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)与RA成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)共培养作为体外细胞模型,将基因的过表达质粒和小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)、模拟剂(mimics)和抑制剂(inhibitors),转染至共培养的RA-FLSs中,研究LINC00638、miR-3184-5p、SOD2对炎症反应和氧化应激的影响。采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术检测LINC00638在RA-FLSs中的细胞定位;通过双荧光素酶报告基因实验、RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)、RNA pull down实验以及功能回复实验,研究LINC00638/miR-3184-5p/SOD2组合的靶向调控关系,以及介导炎症反应、氧化应激的机制。2.2研究二新风胶囊含药血清通过调控LINC00638/miR-3184-5p/SOD2组合对RA-FLSs炎症反应、氧化应激的影响观察XFC含药血清对RA-FLSs增殖、细胞周期以及LINC00638/miR-3184-5p/SOD2组合、炎症细胞因子、氧化应激指标的影响。为探究其作用机制,进行了3个回复实验,在XFC含药血清干预的基础上,分别转染si-LINC00638、si-LINC00638和miR-3184-5p inhibitor、si-LINC00638和pc DNA3.1-SOD2,观察RA-FLSs增殖、细胞周期、炎症细胞因子及氧化应激指标的变化。2.3研究三RA患者LINC00638/miR-3184-5p/SOD2组合与免疫炎症、氧化应激、患者感受指标的相关性分析及新风胶囊对其影响采用自身对照病例研究和关联规则分析的方法研究XFC对RA患者免疫炎症、氧化应激、患者感受指标的影响。检测RA患者PBMCs中的LINC00638/miR-3184-5p/SOD2组合的表达水平,分析其与免疫炎症、氧化应激、患者感受指标的相关性,并且观察XFC对RA患者LINC00638/miR-3184-5p/SOD2组合、炎症细胞因子、氧化应激指标的影响。3结果3.1研究一LINPLX-4720C00638/miR-3184-5p/SOD2组合介导RA成纤维样滑膜细胞炎症反应和氧化应激的机制(1)CCK-8方法筛选RA-PBMCs刺激RA-FLSs的最佳比例和作用时间,结果显示RA-PBMCs与RA-FLSs的最佳数量比例为3:1、最佳作用时间为48h,后续研究均以共培养RA-FLSs作为细胞实验模型。(2)在共培养RA-FLSs中,LINC00638、SOD2表达降低,miR-3184-5p表达升高;此外,白细胞介素(interleukin)-1β、IL-6、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)在共培养RA-FLSs中表达升高,谷胱甘肽(glutathione,GSH)在共培养RA-FLSs中表达降低。(3)RT-q PCR方法检测基因的Landfill biocovers转染效率,结果显示转染pc DNA-LINC00638、pc DNA3.1-SOD2后,RA-FLSs中LINC00638、SOD2的表达升高;转染si-LINC00638、si-SOD2后,RA-FLSs中LINC00638、SOD2的表达降低;转染miR-3184-5p mimics后,RA-FLSs中miR-3184-5p的表达升高;转染miR-3184-5p inhibitor后,RA-FLSs中miR-3184-5p的表达降低。(4)FISH实验结果显示,LINC00638主要分布于RA-FLSs的细胞质中。(5)过表达/干扰LINC00638对miR-3184-5p、SOD2的影响:转染pc DNALINC00638后,RA-FLSs中miR-3184-5p表达降低,SOD2表达升高;转染si-LINC00638后,RA-FLSs中miR-3184-5p表达升高、SOD2表达降低。(6)过表达/干扰LINC00638对RA-FLSs增殖、细胞周期、炎症反应的影响:转染pc DNA-LINC00638,RA-FLSs增殖降低,G1期细胞比例显著升高,G2期和S期细胞比例显著降低,促炎细胞因子IL-6、IL-1β水平降低,抑炎细胞因子IL-4水平升高。转染si-LINC00638,RA-FLSs的增殖增多,G1期细胞比例显著减少,G2期和S期细胞比例显著增多,IL-6、IL-1β的表达升高,IL-4的表达降低。(7)过表达/干扰LINC00638对RA-FLSs氧化应激的影响:转染pc DNA-LINC00638,RA-FLSs中氧化分子MDA、脂质过氧化物(lipid peroxide,LPO)、ROS的表达降低,抗氧化分子GSH、过氧化氢酶(catalase,CAT)的表达升高;转染si-LINC00638,RA-FLSs中MDA、LPO、ROS表达升高,GSH、CAT表达降低。(8)LINC00638/miR-3184-5p/SOD2组合的靶向关系验证:双荧光素酶报告基因实验显示:加入miR-3184-5p mimics后,LINC00638-WT的荧光素酶活性显著降低,而LINC00638-MUT荧光素酶的活性无显著变化。加入miR-3184-5p mimics后,SOD2-WT的荧光素酶活性降低,而SOD2-MUT荧光素酶的活性无显著变化。RIP实验结果显示:与si-NC组相比,si-LINC00638组中AGO2抗体结合了更多的miR-3184-5p和SOD2。RNA pull down实验结果显示:LINC00638 positive探针能够显著富集LINC00638和miR-3184-5p。(9)过表达/抑制miR-3184-5p对SOD2表达的影响:转染miR-3184-5p mimics,RA-FLSs中SOD2的表达降低;转染miR-3184-5p inhibitor,RA-FLSs中SOD2的表达升高。(10)过表达/抑制miR-3184-5p对RA-FLSs增殖、细胞周期、炎症反应的影响:转染miR-3184-5p mimics,RA-FLSs细胞增殖增多,G1期细胞比例减少,G2期和S期比例增加,IL-6、IL-1β的表达升高,IL-4表达降低;与此相反,转染miR-3184-5p inhibitor后,抑制了RA-FLSs的增殖,G1期细胞比例增多,G2期和S期细胞比例减少,IL-6、IL-1β的表达降低,IL-4的表达升高。(11)过表达/抑制miR-3184-5p对RA-FLSs氧化应激的影响:转染miR-3184-5p mimics,RA-FLSs中MDA、LPO、ROS表达升高,GSH、CAT的表达降低;转染miR-3184-5p inhibitor,RA-FLSs中MDA、LPO、ROS的表达降低,GSH、CAT的表达升高。(12)过表达/干扰SOD2对SOD2蛋白表达的影响:转染pc DNA3.1-SOD2,RA-FLSs中SOD2蛋白表达升高;转染si-SOD2,RA-FLSs中SOD2蛋白表达降低。(13)过表达/干扰SOD2对RA-FLSs增殖、细胞周期、炎症反应的影响:转染pc DNA3.1-SOD2,RA-FLSs增殖显著减少,G1期细胞比例增多,G2期和S期比例减少,IL-6、IL-1β表达降低,IL-4表达升高;转染si-SOD2,RA-FLSs增殖显著增加,G1期细胞比例减少,G2期和S期比例升高,IL-6、IL-1β水平升高,IL-4水平降低。(14)过表达/干扰SOD2对RA-FLSs氧化应激的影响:转染pc DNA3.1-SOD2,RA-FLSs中MDA、LPO、ROS的表达降低,GSH、CAT的表达升高;转染si-SOD2,RA-FLSs中MDA、LPO、ROS的表达升高,GSH、CAT的表达降低。(15)回复实验1:在转染pc DNA-LINC00638的基础上,共转染miR-3184-5p mimics,能够促进RA-FLSs的增殖及细胞周期进展,提高促炎因子IL-1β、IL-6及氧化分子MDA、LPO、ROS的水平,降低抑炎细胞因子IL-4及抗氧化分子SOD2、GSH、CAT的水平。(16)回复实验2:在转染miR-3184-5p mimics的基础上,共转染pc DNA3.1-SOD2,能够抑制RA-FLSs增殖及周期进展,降低IL-1β、IL-6、MDA、LPO、ROS表达水平,升高IL-4、SOD2、GSH、CAT表达水平。(17)回复实验3:在转染pc DNA-LINC00638的基础上,共转染si-SOD2,能够促进RA-FLSs的增殖及细胞周期进展,升高IL-1β、IL-6、MDA、LPO、ROS的表达水平,降低IL-4、SOD2、GSH、CAT的表达水平。3.2研究二新风胶囊含药血清通过调控LINC00638/miR-3184-5p/SOD2组合对RA-FLSs炎症反应、氧化应激的影响(1)CCK-8实验筛选XFC含药血清作用于RA-FLSs的最佳浓度和时间,结果显示,20%为最佳作用浓度,48h为最佳作用时间,后续研究采用此浓度和时间进行实验。(2)XFC含药血清对RA-FLSs中LINC00638/miR-3184-5p/SOD2组合、细胞增殖、周期、炎症及氧化应激的影响:结果显示,经XFC含药血清干预后,RA-FLSs中LINC00638、SOD2表达升高,miR-3184-5p表达降低,RA-FLSs增殖及周期进展受到抑制,促炎因子IL-1β、IL-6及氧化分子MDA、LPO、ROS水平降低,抑炎细胞因子IL-4及抗氧化分子SOD2、GSH、CAT的水平升高。(3)回复实验1:在XFC含药血清干预的基础上,转染si-LINC00638,能够促进RA-FLSs增殖和周期进展,提高IL-1β、IL-6、MDA、LPO、ROS表达水平,降低IL-4、SOD2、GSH、CAT的表达水平。(4)回复实验2:在XFC含药血清干预和转染si-LINC00638的基础上,共转染miR-3184-5p inhibitor,能够抑制RA-FLSs的增殖及细胞周期进展,降低IL-1β、IL-6、MDA、LPO、ROS的水平,升高IL-4、SOD2、GSH、CAT的水平。(5)回复实验3:在XFC含药血清干预和转染si-LINC00638的基础上,共转染pc DNA3.1-SOD2,能够抑制RA-FLSs增殖及细胞周期进展,降低IL-1β、IL-6、MDA、LPO、ROS的水平,升高IL-4、SOD2、GSH、CAT的水平。3.3研究三RA患者LINC00638/miR-3184-5p/SOD2组合与免疫炎症、氧化应激、患者感受指标的相关性分析及新风胶囊对其影响(1)LINC00638/miR-3184-5p/SOD2组合在RA患者中的表达:与健康对照组相比,RA患者PBMCs中LINC00638、SOD2表达降低,miR-3184-5p表达升高(P<0.01)。通过受试者工作特征曲线分析显示:LINC00638、miR-3184-5p、SOD2的曲线下面积分别为91.93%(95%CI:0.863-0.976)、83.07%(95%CI:0.739-0.922)和92.20%(95%CI:0.861-0.983)。(2)LINC00638/miR-3184-5p/SOD2组合与RA患者免疫炎症、氧化应激、患者感受指标的相关性分析:LINC00638与miR-3184-5p、病程、ESR、DAS28评分、MDA水平呈负相关,与SOD2、BP评分呈正相关(P<0.01);miR-3184-5p与LINC00638、脾虚湿盛积分、BP评分、VT评分呈负相关(P<0.01);SOD2与ESR、DAS28评分、ROS呈负相关,与LINC00638、RP评分、BP评分、SF评分、MH评分呈正相关(P<0.01)。(3)RA患者治疗前后免疫炎症、氧化应激、患者感受指标的变化:与治疗前相比,RA患者治疗后DAS28评分、ESR、hs-CRP、RF、anti-CCP、IGA、IGG、IGM、C3、C4、VAS、SAS、SDS、脾虚湿盛积分均降低(P<0.05或P<0.01),而SOD的水平以及PF、RP、BP、GH、VT、SF、RE、MH评分均升高(P<0.01)。(4)XFC与RA患者免疫炎症、氧化应激、患者感受指标改善的关联规则分析:XFC的治疗与ESR、hs-CRP、RF、DAS28评分、脾虚湿盛积分、VAS评分、SDS评分、SAS评分的降低呈强关联,与SF评分、PF评分、BP评分、MH评分、GH评分、VT评分、RP评分的升高具有强关联,以上结果的规则支持度均大于40%,置信度均大于70%,提升度均大于1。(5)XFC对RA患者LINC00638/miR-3184-5p/SOD2组合、炎症细胞因子、氧化应激指标的影响:与治疗前相比,治疗后RA患者PBMCselleckchem PF-6463922s中LINC00638、SOD2表达水平升高,miR-3184-5p表达水平降低(P<0.01),促炎细胞因子IL-6以及氧化分子ROS、MDA的水平降低,抑炎因子IL-4、抗氧化分子GSH水平升高(P<0.01)。4结论(1)LINC00638作为ce RNA竞争性结合miR-3184-5p,调控SOD2的表达,介导RA炎症反应和氧化应激。(2)XFC含药血清能上调LINC00638、SOD2的表达,下调miR-3184-5p的表达,抑制RA-FLSs增殖及细胞周期进展,降低炎症反应和氧化应激。(3)RA患者LINC00638/miR-3184-5p/SOD2组合与免疫炎症、氧化应激、患者感受指标具有相关性;XFC能够调节RA患者LINC00638、miR-3184-5p、SOD2的表达水平,降低免疫炎症反应和氧化应激,改善患者感受,缓解病情。