流行性感冒是由流感病毒(influenza virus,Ⅳ)E7080 IC50引起的急性呼吸道传染病,简称流感。20www.selleck.cn/products/q-vd-oph09年2月,墨西哥出现首例H1N1报告病例,同年4月,世界卫生组织(WHO)宣布H1N1为具有全球重要性的突发公共卫生事件。流感病毒往往通过基因重组逃避宿主免疫系统,导致病毒传播大流行暴发,严重威胁人类健康与社会经济发展。COVID-19 mRNA疫苗在疾病预防方面效果显著、制备周期短,目前的流感疫苗基于灭活病毒或重组蛋白,保护率只有40%-60%,因此制备安全、有效的mRNA疫苗为预防和控制H1N1所致的流感极其重要。本文以季节性H1N1亚型流感病毒为模型开展mRNA疫苗制备研究,血凝素(HA)是诱导针对Ⅳ保护性免疫反应的主要抗原,是关键的疫苗靶点。5’UTR和3’UTR的长度对mRNA的翻译效率有一定的影响;GC含量和U含量可影响mRNA的稳定性和免疫原性。研究通过基因序列优化、递送系统、佐剂联合,制备针对H1N1亚型流感病毒的mRNA候选疫苗,评价疫苗的免疫效果,为流感病毒mRNA疫苗的制备提供新的思路和理论依据。主要研究内容及结果包括以下三部分:1.H1N1亚型流感病毒mRNA候选疫苗表达载体的构建本研究以季节性流行的H1N1亚型流感病毒为模型,以HA基因全长为基础进行密码子优化得到两段序列,分别命名为:JLH1HA、JLHA,将其克隆至三种载体:pGEM-T7-Hα(UTRs来自人源α球蛋白)、pGEM-T7-Mα(UTRs来自鼠源α球蛋白)、pGEM-n3(UTRs来自人源β球蛋白),获得6种重组质粒。经酶切鉴定正确后,对重组质粒进行线性化处理、体外转录、纯化、加帽等,结果获得6种Cap-mRNA。通过免疫印迹试验(Western blot)和间接免疫荧光试验(IFA)证实,6种Cap-mRNA均能表达目的蛋白,且pGEM-T7-Hα载体表达效率最高。为pGEM-T7-Hα-JLHA和pGEM-T7-Hα-JLH1HA制备mRNA候选疫苗提供了条件。2.LNP/mRNA纳米颗粒的制备及佐剂的选择将SM-102(1-辛基壬基8-[(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷氧基)己基]氨基]-辛酸酯)作为可电离脂质,参考文献及前期研究成果确定LNP与mRNA最佳N/P摩尔比为5.8:1后,通过微流控制备LNP/mRNA复合物纳米颗粒。透射电子显微镜(TEM)显示纳米颗粒为220nm左右的均一球体,zeta电位值为1.47mV。通过体外转染试验及Western blot证实,不同形式的抗原基因可获得表达。将佐剂R848(Toll样受体激动剂TLR8)、MK-571(一种白三烯受体拮抗剂)分别与LNP包裹的mLuc(荧光素酶)免疫C57BL/6小鼠,通过小动物活体成像试验验证,结果表明佐剂的添加能够刺激抗原基因的表达,MK-571佐剂组呈现的荧光值高于R848佐剂组、高于未添加佐剂组。证明MK-571是较好的佐剂,能提高疫苗的免疫效果。3.H1N1亚型流感病毒mRNA候选疫苗的制备及免疫效果评价研究选择 pGEM-T7-Hα-JLHA 和 pGEM-T7-Hα-JLH1HA 制备 mRNA 候选疫苗,制备LNP/mRNA复合物纳米颗粒,联合MK-571、R848佐剂,设立6组疫苗组:LNP/mJLHA、LNP/mJLHA+R848、LNP/mJLHA+MK-571、LNP/mJLH1HA、LNP/mJLH1HA+R848、LNP/mJLH1HA+MK-571,同时设立PBS阴性对照组。通过血凝抑制试验(HI)、流式细胞术检测各组产生抗体水平,结果表明应用mJLH1HA基因的疫苗组抗体水平较高,且MK-571佐剂组>R848佐剂组>无佐剂组;攻毒期间,通过RT-PCR、双germline genetic variants抗体夹心ELISA检测肺组织炎症因子水平并制备肺部病理切片,结果表明各疫苗组炎症反应显著低于PBS组;记录攻毒期间小鼠体重及存活率,添加佐剂的疫苗组攻毒后的生存率为100%。因此,mJLH1HA基因的优化方式提升了疫苗效果,同时证明MK-571 佐剂增强 mRNA 疫苗的免疫保护效果。