在全球的酶制剂市场中,对于蛋白酶的需要与配额相较于其他酶制剂产品而言是最高的。酸性蛋白酶是蛋白酶制剂中的一大类,是十分重要的工业加工生产用酶。本研究通过建立里氏木霉外源基因表达系统,从而实现稳定地获取酸性蛋白酶,并对其性质进行改造。为了快速高效的对里氏木霉转化子进行筛选,构建了以植物表达载体pCAMBIA2301为基础,潮霉素与绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein gene,GFP)双重筛选标记的可视化丝状真菌表达载体。并采用神经网络手段对根癌农杆菌转化法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)介导下的里氏木霉外源基因的转化条件进immediate breast reconstruction行优化,最终实现了proA酸性蛋白酶基因的表达。基于现有性质与工业生产要求进行对proA进行理性设计,旨在使proA酸性蛋白酶可以更好的满足相关工业生产中的应用,因而,最终得到了proA耐热型突变体与proA酶活提高突变体。具体研究结果如下:(1)通过对里氏木霉CICC40932的耐受性测试,确定了以潮霉素作为抗性筛选标记,其筛选浓度为200 mg/mL。基于植物表达载体pCAMBIA2301构建了具有潮霉素抗性筛选标记与绿色荧光蛋白标记的可视化筛选载体,并成功的在激发光场下实现了阳性转化子的荧光激发。将ATMT法所介导的里氏木霉转化条件进行分类优化,以ATMT法中所使用的农杆菌种类与共培养温度为单因素优化组;设置乙酰丁香酮浓度,共培养时间,农杆菌所占比例,农杆菌前诱导时间,共培养培养基初始p H为多因素优化组进行优化。利用BP神经网络与GA遗传算法对转化条件进行拟合与寻优,最终确定了农杆菌种类为AGL1,共培养温度24.5℃,乙酰丁香酮浓度为225μmol/L,共培养时间为52 h,农杆菌菌液比55%,农杆菌前诱导时间为6 h,培养基初始p H为5.4的转化条件。优化后的最大阳性转化子数量可达118个/10~6,最低为96个/10~6。与优化前相比平均提高了6.2倍。(2)通过里氏木霉内源基因Cbh1的表达盒,构建了可视化筛选表达载体Tr2301-Cbh,并在里氏木霉CICC40932中实现了来自红褐肉座菌的酸性蛋白酶基因Pro A的表达。对里氏木霉进行发酵,并对发酵过程进行监测。最终确定在27℃,150 r/mi购买Erastinn的条件下,发酵144 h后发酵液中蛋白酶酶活最高,此时酶活达到344.12±11.182 U/mL。(3)基于对proA酸性蛋白酶的空间结构分析对其热稳定性以及酶活力进行改造。对proA的G220-S290区域人工引入二硫键,以期提高proA的热稳定性。通过软件CAVER的分析,得到蛋白内底物通道构成残基。对蛋白通道内部残基进行改造,以期提高proA酶活力。对引入二硫键的突变体进行热稳定性变化的测量,突变体S294C-S296C相较于野生型proA,55℃下耐受30 min后,剩余酶活提高了15.6%。而通过对内部残基的改造,获得点击此处了D77G酶活力提升突变体,相较于野生型proA蛋白,突变体在50℃,p H为3.0的环境下酶活力提升了24%。D77G突变体酶活力为428.40±12.671 U/mL。综上所述,本研究成功的构建了里氏木霉可视化筛选载体。并基于该载体完成了酸性蛋白酶基因在里氏木霉表达系统中的表达。同时对酸性蛋白酶进行了分子改造,为丝状真菌表达系统,理性设计等的研究提供了参考。