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旨为探索bta-miR-2285f和宿主基因TANK结合激酶1(TANK binding kinase 1,TBK1)的生物学功能，以及bta-miR-2285f与靶基因互作调节奶牛乳脂代谢的潜在机制，本研究通过生物信息学方法分析bta-miR-2285f在不同物种间的保守性，并通过上游序列CPG岛分析、启动子预测、进一步进行组织表达谱分析，预测靶基因并进行GO功能和KEGG通路富集分析。利用双荧光素酶报告试验验证bta-miR-2285f调控的下游靶基因钙结合蛋白39(Calcium binding protein 39,CAB39),并在乳腺上皮细胞水平探究bta-miR-2285f的功能作用。结果表明：1)bta-miR-2285f是牛特异性miRNA,属于内含子miRNA;2)bta-miR-2285f与宿主基因TBK1上游序列2 kb处均不含有CPG岛。bta-miR-2285f在上游586 bp处为转录起始位点。宿主基因TBK1在上游105 bp处为转录起始位点；3)TargetScan和miRWalk预测miR-2285f有172个交集靶基因，主要参与新陈代谢、遗传信息传递、信号分析和selleckchem细胞的相互作用，并且显著富集到mTOR信号通路、PI3K-AKT信号通路、ErbB信号通路、Hippo信号通路以及甘油酯代谢等乳脂代谢相关的信号通路并在STRING数据库中构建bta-miR-2285f靶基因之间的互作网络图；4)bta-miR-2285f在奶牛乳腺组织中的表达水平最高，与其他组织存在显著差异(P<0.05);5)双荧光素酶报告基因试验证明bta-miR-2285f与基因CAB39的3’非翻译区(UTR)种子序列具有直接的靶向关系并且bta-miR-2285f mimic显著上调乳脂标志基因ELOVL6、SLC27A6、PPARG和FASN的表达，bta-miR-2285f inhibitor则具有相反的作用。综上，bta-miR-2285f-1可genetic nurturance能通过反馈调节宿主基因TBK1从而参与乳脂代谢过程，并且bta-miRMicrobiology抑制剂-2285f通过靶向基因CAB39进而参与奶牛乳脂代谢过程，为进一步探究bta-miR-2285f在中国荷斯坦奶牛乳脂代谢中的潜在机制提供基础。

背景:糖尿病是以血糖升高为典型内环境变化的一种常见慢性代谢性疾病,有骨质疏松等数十种并发症。高血糖状态影响成骨细胞和破骨细胞的生物学行为,破坏骨形成和骨吸收间的动态平衡,降低骨组织单位体积骨量、增加骨脆性,最终导致骨质疏松的发生,称为糖尿病性骨质疏松(Diabetic Osteoporosis,DOP)。目前,糖尿病性骨质疏松的治疗方式以治疗高血糖为主,并联合抗骨质疏松治疗、饮食管理和运动锻炼等其他治疗手段。降糖治疗(胰岛素、噻唑烷二酮类和磺脲类降糖药)可能降低患者骨矿物质密度,增加骨折风险;抗骨质疏松药物特立帕肽与患者空腹血糖升高有关。运动锻炼在调节血糖的同时能对抗骨质流失,但摔倒风险增加,且部分肥胖患者运动锻炼意愿不高。高频率低载荷HBV hepatitis B virus机械振动(Low-magnitude High-frequency Vibration,LMHFV)是一种“被动”运动形式,患者只需手握扶手站立于机械振动台上,相较传统运动锻炼安全性更高。LMHFV因高频率低载荷(20-90Hz,加速度<1g)的振动特点,在引起机体力学效应的同时避免了对人体健康的损害。本课题组近期研究发现,LMHFV能够降低糖尿病大鼠血糖、改善股骨骨矿物质密度、骨微结构和力学性能。然而,LMHFV改善糖尿病性骨质疏松的机理仍不明确,LMHFV对高糖环境下成骨细胞和破骨细胞的作用及其中分子机制有待进一步研究。方法:体外实验:1、成骨细胞:(1)将MC3T3-E1细胞培养于高葡萄糖浓度的培养液中构建高糖环境成骨细胞模型;将LMHFV加载于高糖环境培养的MC3T3-E1细胞构建高糖环境下成骨细胞的LMHFV治疗模型。(2)CCK8法检测MC3T3-E1细胞活性;鬼笔环肽染色观察MC3T3-E1细胞骨架。(3)蛋白免疫印迹技术(Western Blot,WB)和酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测MC3T3-E1细胞的成骨相关蛋白表达。(4)碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)染色和茜素红S(Alizarin Red S,ARS)染色分析MC3T3-E1细胞分化矿化情况。(5)m RNA测序技术检测MC3T3-E1细胞基因表达情况;R语言的limma包筛选组间差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs);对差异表达基因进行功能通路富集分析和蛋白网络互作分析,寻找LMHFV敏感的关键信号通路和核心基因。(6)免疫荧光观察MC3T3-E1细胞初级纤毛的形态和长度;IFT88sh RNA构建初级纤毛敲除的MC3T3-E1细胞模型。2、破骨细胞:(1)将RAW264.7细胞培养于高糖培养液中构建高糖环境破骨细胞模型;将LMHFV加载于高糖环境培养的RAW264.7细胞构建高糖环境下破骨细胞的LMHFV治疗模型。(2)RANKL诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化;抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant Acid Phosphatase,TRAP)染色法检测成熟破骨细胞。(3)蛋白免疫印迹技术(WB)和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测破骨相关蛋白表达;骨吸收实验检测破骨细胞的骨吸收能力;Transwell实验检测RAW264.7细胞的迁移能力。(4)慢病毒转染构建MMP9过表达的RAW264.7细胞模型。(5)Discovery Studio软件评估MMP9蛋白结构,并对高选择性MMP9拮抗剂进行药效团分析;Shordinger软件进行MMP9蛋白结构和高选择性MMP9拮抗剂的虚拟对接分析;GROMACS软件进行分子动力学模拟分析。体内实验:(1)链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)构建糖尿病大鼠模型,并施加LMHFV加载。(2)体重秤和血糖仪测量大鼠体重和血糖。(3)Micro-CT扫描分LGX818化学结构析大鼠胫骨近端骨矿物质密度和骨微结构。(4)苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)和马松(Masson)染色法观察大鼠胫骨近端骨组织形态。(5)免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色法检测大鼠胫骨组织中PI3K、AKT、TRAP和MMP9的表达情况。结果:体外实验:1、成骨细胞:(1)高糖环境抑制MC3T3-E1细胞活性、降低成骨相关蛋白表达、阻碍成骨分化,25.5mmol/L葡萄糖浓度的高糖环境作用显著。LMHFV改善高糖环境下MC3T3-E1细胞分化、成熟和矿化等生物学行为,Dolutegravir抑制剂加载30分钟效果最佳。(2)生理环境和高糖环境下,LMHFV加载所调节的基因分别有150个和147个。PI3K/AKT信号通路与LMHFV密切相关。MMP9表达对LMHFV敏感。PI3K/AKT信号通路与糖尿病和骨质疏松的发生发展有关。(3)MC3T3-E1细胞表达初级纤毛。高糖环境减少MC3T3-E1细胞初级纤毛的长度。LMHFV激活高糖环境下MC3T3-E1细胞被抑制的PI3K/AKT信号通路。(4)IFT88sh RNA能够敲除MC3T3-E1细胞的初级纤毛。无力学刺激加载的条件下,初级纤毛敲除不影响MC3T3-E1细胞的生物学行为和PI3K/AKT信号通路。(5)高糖环境下LMHFV通过初级纤毛激活PI3K/AKT信号通路。LMHFV通过初级纤毛-PI3K/AKT信号通路促进高糖环境下MC3T3-E1细胞的分化、成熟和矿化。2、破骨细胞:(1)RANKL能够诱导RAW264.7细胞分化为成熟破骨细胞。(2)LMHFV加载下破骨细胞分化、成熟、骨吸收和破骨前体细胞迁移被抑制。LMHFV降低MMP9的表达,调节MMP9上游的TRAF6-ERK/p38MAPK信号通路。(3)MMP9过表达促进破骨细胞分化、成熟,增强骨吸收。LMHFV通过降低MMP9蛋白表达抑制破骨细胞。(4)高选择性MMP9拮抗剂JNJ0966和MMP9-IN-1可成功与MMP9蛋白结构对接,对接评分别为-6.629和-8.618。MMP9与其高选择性拮抗剂形成的复合物能稳定存在。(5)JNJ0966和MMP9-IN-1抑制破骨细胞分化、成熟、骨吸收和破骨前体细胞的迁移。体内实验:(1)LMHFV降低糖尿病大鼠血糖,缓解其体重下降。(2)糖尿病大鼠胫骨近端的骨矿物质密度(Bone Mineral Density,BMD)、骨小梁体积分数(Bone Volume/Tissue Volume,BV/TV)、骨小梁数目(Trabecular Number,Tb.N)和骨小梁厚度(Trabecular Thickness,Tb.H)均降低,骨小梁分离度(Trabecular Separation,Tb.Sp)增加。LMHFV改善糖尿病大鼠胫骨近端骨微结构。(3)糖尿病大鼠胫骨近端骨组织形态被破坏,LMHFV能够对抗该破坏作用。(4)LMHFV增加糖尿病大鼠胫骨组织PI3K和AKT的表达。(5)LMHFV抑制糖尿病大鼠胫骨组织TRAP和MMP9的表达。结论:1、25.5mmol/L葡萄糖浓度的高糖环境对成骨细胞分化、成熟和矿化的抑制作用显著;LMHFV能够改善高糖环境下成骨细胞的生物学行为,且加载30分钟时效果最佳。2、初级纤毛-PI3K/AKT信号通路参与LMHFV改善高糖环境下成骨细胞的生物学行为。3、LMHFV抑制破骨细胞分化、成熟、骨吸收和破骨前体细胞的迁移;MMP9参与LMHFV对破骨细胞的抑制。4、LMHFV降低糖尿病大鼠的血糖、缓解其体重下降,改善糖尿病大鼠胫骨骨矿物质密度、骨微结构和骨组织形态。

目的 观察“开穴解锁”推拿法治疗乳腺增生症的临床疗效。方法 将72例乳腺增生患者随机分为开穴解锁组36例(脱落2例)及对照组36例(脱落1例)。开穴解锁组予以“开穴解锁”推拿法治疗，治疗1次间隔2天，连续治疗15次为1个疗程，共治疗2个疗程。对照组予乳癖散结胶囊治疗，45天为1个疗程，治疗2个疗程后进行评价。比较两组患者治疗前后乳房疼痛视觉模拟(VAS)评分，乳腺肿块大小、质地、分布范围评分，乳腺彩超检查(乳腺腺体层厚度、输乳管内径及低回声区直径)和临床疗效。结果 两组治疗后VAS评分，乳腺肿块大小、质地、分布范围评分，乳腺腺体层厚度、输乳管内径、低回声区直径均较本组治疗前显著降低(P<确认细节0.05)。治疗后，两组肿块分布范围评分、乳腺腺体层厚度、输乳管内径无明显差异(P>0.05)。但开穴解锁组VAS评分，乳腺肿块大小、质地评分，低回声区直径及临床疗效均较对照组改善更CHIR-99021体内显著(P<0.05)。结论 “开穴解锁”推拿法可有效减轻乳腺增生症引起的乳房疼痛，软化肿块，缩epigenetic reader小肿块范围。

为研究一氧化氮（nitricoxide,NO）对扁豆采后贮藏品质的影Rodent bioassays响，本实验以硝普纳（sodium nitroprusside,S3-MA MWNP）为外源NO供体，采用0.2mmol/L浓度的SNP溶液浸泡处理扁豆10min（以蒸馏水浸泡为对照），分析（20±1）℃和80%～90%相对湿度条件下贮藏期间扁豆腐烂率、锈斑率、硬度、总可溶性固形物（total soluble solid,TSS）质量分数、丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量、类黄酮含量、总酚含量、叶绿素含量以及抗氧化酶（过氧化物酶（peroxidase,POD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammoniase,PAL）、过氧化氢酶（catalase,CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase,APX））活力的变化情况。结果表明，外源NO处理可以抑制扁豆腐烂和锈斑的产生，使扁豆保持较好的光泽和硬度，同时对TJNJ-42756493说明书SS和叶绿素的降解起到抑制作用，使扁豆保持良好的感官品质。外源NO处理还可以抑制MDA积累，提高总酚和类黄酮的含量。此外，外源NO处理还可以保持扁豆贮藏过程中PAL、CAT和APX活力，抑制组织中POD和PPO活力的增加，从而增强扁豆的抗氧化能力，延缓扁豆成熟衰老。结论：外源NO处理可以延缓扁豆采后成熟衰老，维持扁豆在贮藏期间的生理品质，有效延长扁豆保鲜期。

随着人们生活方式的改变及人口老selleck INCB28060龄化,脑血管疾病(cerebrovascular disease;CVD)成为全球重点防治的三大疾病之一,其中患缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke;CIS)的病人数在所有CVD患者的占比一直居高不下,尽管临床上有许多药物应用于CVD的预防、发现与诊疗阶段,且急性发病期的血管再通以及再通后的脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia/reperfusion injury;CIRI)相关的治疗方面均有所成就,但如何更好地发现疗效好且经济实惠的药物方面的问题也亟待解决。祖国中医药已有近五千年的发展史,对于CVD的治疗具有丰富的临床经验,且中药复方兼具疗效好与经济实惠的优点,可广泛应用于临床;但中药复方具体的治疗机制并不完全明确,如何通过现代化的技术手段研究和阐释中药复方的治疗机制成为了目前研究的重点。补阳还五汤是中医治疗气虚血瘀型卒中的传统方剂,由黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、桃仁、红花组成,其益气、活血、通络的功效,对治疗气虚血瘀型卒中疗效甚佳。本实验室前期研究也证实补阳DENTAL BIOLOGY还五汤可以通过细胞凋亡、自噬等多重途径治疗脑卒中以及减轻卒中后的再灌注损伤。铁死亡(ferroptosis)是2012年提出的新型细胞死亡方式,众多研究表明铁死亡与CIRI的发生发展密切相关,且有研究表明黄芪、当归、红花等单味药的主要成分可以通过抑制铁死亡对CIRI起到一定的治疗作用。但是补阳还五汤是否可以通过铁死亡途径抗CIRI目前尚不清楚。课题以SD大鼠与HT22细胞为研究对象,从在体和离体两个方面探究补阳还五汤是否可以基于铁死亡途径抗CIRI。本研究共分为三个部分:1.脑血流量降低对大鼠大脑中动脉栓塞/再灌注(MCAO/R)模型的效果研究;2.补阳还五汤通过调控大鼠脑铁代谢抗脑缺血再灌注损伤的研究;3.补阳还五汤通过调控铁离子代谢减轻OGD/R模型HT22细胞损伤的研究。第一部分脑血流量降低对大鼠大脑中动脉栓塞/再灌注模型的效果研究目的:探讨脑血流量的变化值对制备大鼠MCAO/R模型的效果。方法:取体重为250 g～280 g健康雄性SD大鼠25只,随机分为5组:A组(脑血流量下降10%～20%)、B组(脑血流量下降21%～30%)、C组(脑血流量下降31%～40%)、D组(脑血流量下降41%～50%)、E组(脑血流量下降51%～60%)。所有动物均采用改良线栓法制备MCAO/R模型,且均在激光散斑血流灌注成像仪监测下进行模型制备。所有入组大鼠均于再灌注24 h进行神经功能评分观察模型成功率。再灌注72 h后计算大鼠梗死后死亡率、观察并纪录体重变化情况、TTC染色检测脑梗死体积。结果:梗死后死亡率:E组为40%(2只),A、B、C、D组均为0。A组大鼠神经功能评分正常、无脑组织梗死,因此以A组大鼠作为基本对照组。神经功能评分:与A组相比,B组大鼠神经功能评分无显著性差异(P>0.05),C、D、E各组大鼠神经功能评分明显升高(P<0.01);其中C、D组之间无显著性差异(P>0.05),E组高于D组(P<0.05)。体重变化情况:A、B组无明显差异(P>0.05),C、D、E三组较A组体重下降明显(P<0.01),变化幅度顺序为E>D>C>B;且每组均较前一组比较体重下降明显(P<0.05)。脑梗死体积:与A组相比,B、C、D、E组大鼠脑梗死灶明显(P<0.01),梗死体积顺序为E>D>C>B;且每组均较前一组比较脑梗死体积更为显著(P<0.05)。小结:大鼠MCAO/R模型制备过程中缺血侧脑血流量下降百分比在41%～50%之间模型效果最佳,MCAO/R模型成功率高、重复性及稳定性好。第二部分补阳还五汤通过调控大鼠脑铁代谢抗脑缺血再灌注损伤的研究目的:探究补阳还五汤调控铁代谢抑制铁死亡抗CIRI的机制研究方法:将60只清洁级雄性SD大鼠采用随机分组的方式分为4组:假手术组(Sham组)、模型组(MCAO/R组)、补阳还五汤组(BYHWD组)、阳性对照组(甲磺酸去铁胺,DFO组),每组各15只。除Sham组外,其余三组均建立MCAO/R模型缺血2 h再灌注72 h。其中对BYHWD组和DFO组大鼠分别给与补阳还五汤和甲磺酸去铁胺干预处理,其余两组予以等量生理盐水。所有大鼠均在再灌注72 h后,采用Zea longa神经功能学评分以及黏胶揭除实验评估神经功能缺损情况和躯体感觉损伤情况;采用TTC染色检测脑组织梗死体积;采用HE染色及尼氏染色观察组织形态及神经元;采用普鲁士蓝染色观察铁沉积情况;采用透射电镜观察神经元及线粒体结构;采用酶联免疫吸附实验(Elisa法)检测MDA、GSH以及组织铁含量。采用Western Blot法检测Tf R1、DMT1、FPN1、GPX4蛋白表达水平;免疫荧光染色法检测蛋白GPX4的表达水平。结果:Sham组大鼠没有明显的神经功能缺损、躯体感觉损伤和脑组织梗死现象;组织染色显示脑组织结构紧密,神经元形态正常,数量丰富,多见尼氏小体,未见明显脑铁沉积。透射电镜显示神经元线粒体结构正常,线粒体嵴及外膜完整。酶联免疫吸附实验结果显示Sham组大鼠组织铁含量及血清MDA水平较低,GSH水平较高;蛋白印迹实验及免疫荧光实验结果显示Sham组大鼠脑组织内的FPN1、GPX4蛋白表达丰富,Tf R1、DMT1的表达较低。与Sham组大鼠相比,MCAO/R组大鼠神经功能缺损与躯体感觉损伤明显,神经功能学评分增高;脑组织梗死体积明显增加;组织染色显示脑组织结构疏松,神经元排列紊乱,数量明显减少,神经元水肿明显,空泡样、核固缩等病理现象多见,尼氏小体明显减少,脑铁沉积量明显增多;透射电镜显示线粒体明显肿胀,基质溶解,嵴减少,部分严重者外膜破裂、崩解。酶联免疫吸附实验结果显示:MCAO/R组大鼠组织铁含量及血清MDA水平明显升高(P<0.01),GSH水平明显降低(P<0.01);蛋白印迹实验及免疫荧光实验结果显示:MCAO/R组大鼠脑组织内的FPN1、GPX4蛋白表达显著减少(P<0.05),蛋白Tf R1、DMT1的表达量明显增高(P<0.05)。与MCAO/R组大鼠相比,BYHWD组和DFO组大鼠神经功能缺损与躯体感觉损伤明显减轻,神经功能学评分减少;脑组织梗死体积明显降低;组织染色显示脑组织结构相对紧密,神经元数量明显增多,神经元水肿明显减轻,空泡样、核固缩等病理现象显著减少,尼氏小体明显减少,脑铁沉积量明显增多;透射电镜显示神经元中线粒体部分轻度肿胀,线粒体嵴较多,外膜完整,损伤明显减轻。酶联免疫吸附实验结果显示:BYHWD组和和DFO组大鼠组织铁含量及血清MDA水平明显降低(P<0.01),GSH水平明显升高(P<0.01);蛋白印迹实验及免疫荧光实验结果显示:BYHWD组和DFO组大鼠脑组织内的蛋白FPN1、GPX4表达增多(P<0.05),蛋白Tf R1、DMT1的表达量降低(P<0.05)。与DFO组大鼠相比,BYHWD组大鼠神经功能缺损、躯体感觉损伤、脑组织梗死体积、组织染色以及电镜均无明显差异(P>0.05)。酶联免疫吸附实验结果显示:BYHWD组大鼠组织铁含量和GSH水平无明显差异(P>0.05),MDA水平明显减少(P<0.05);蛋白印迹实验及免疫荧光实验结果显示:BYHWD组大鼠脑组织FPN1、Tf R1、DMT1蛋白表达无明显差异(P>0.05),GPX4蛋白表达明显增高(P<0.05)。小结:补阳还五汤可以通过降低脑组织中蛋白Tf R1、DMT1的表达,增强FPN1、GPX4的表达,降低大鼠缺血再灌注侧半暗带区脑组织中的铁离子含量,抑制了因过量铁参与芬顿反应产生的活性氧及随后的有毒脂质过氧化物蓄积引起的铁死亡,减轻CIRI,促进脑组织神经功能的恢复。第三部分补阳还五汤通过调控铁离子代谢减轻氧糖剥夺/复氧复糖HT22细胞损伤的研究目的:探究补阳还五汤通过调控铁离子代谢抑制铁死亡减轻OGD/R模型HT22细胞损伤的作用机制。方法:通过建立OGD/R模型,将HT22细胞随机分为:正常组(Control)、模型组(OGD/R)、模型+补阳还五汤含药血清组)(1%BYS、3%BYS、5%BYS、7%BYS、10%BYS)、模型+空白血清组(1%CS、3%CS、5%CS、7%CS、10%CS),通过CCK-8法和检测LDH(乳酸脱氢酶)漏出率探讨补阳还五汤含药血清对HT22细胞OGD/R损伤模型保护作用的最适浓度;再将HT22细胞分为对照组(Control)、模型组(OGD/R)、模型+补阳还五汤含药血清组(OGD/R+BYHWDS)以及模型+阳性对照组(OGD/R+DFO),通过Elisa法检测各组细胞MDA、GSH的含量;通过流式检测各组细胞ROS的含量;通过荧光探针法检测各组细胞内Fe~(2+)含量;通过Western Blot法检测各组细胞铁稳态相关蛋白Tf R1、FPN1、DMT1、GPX4的表达水平;通过免疫荧光染色法检测各组细胞蛋白Tf R1、FPN1、DMT1、GPX4的表达水平。结果:CCK-8法、LDH漏出率检测结果说明低浓度补阳还五汤含药血清均能不同程度增强缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞活力,降低LDH漏出率,对神经元起到保护作用。其中以3%补阳还五汤含药血清治疗效果最佳,故本实验选择浓度为3%的补阳还五汤含药血清用于后续实验研究。Control组神经元的GSH含量较高,ROS、MDA、Fe~(2+)含量较低;蛋白印记实验显示:Tf R1、DMT1蛋白表达较少,FPN1、GPX4蛋白表达丰富;免疫荧光实验显示:Tf R1、DMT1蛋白的平均荧光强度弱,蛋白FPN1、GPX4表达的平均荧光强度强。与Control组相比,OGD/R组神经元的GSH含量明显降低(P<0.01),ROS、MDA、Fe~(2+)含量均明显升高(P<0.01);蛋白印记实验显示:蛋白Tf R1、DMT1表达水平显著升高(P<0.05),蛋白FPN1、GPX4表达水平显著降低(P<0.05);免疫荧光实验显示:Tf R1、DMT1蛋白的平均荧光强度显著升高(P<0.05),FPN1、GPX4蛋白的平均荧光强度显著降低(P<0.05)。与OGD/R组相比,BYHWDS组和DFO组神经元细胞中的GSH含量明显升高,ROS、MDA、Fe~(2+)含量均明显降低(P<0.01);蛋白印记实验显示:蛋白Tf R1、DMT1表达水平显LXH254著降低(P<0.05),蛋白FPN1、GPX4表达水平显著升高(P<0.05);免疫荧光实验显示:Tf R1、DMT1蛋白表达的平均荧光强度明显变弱(P<0.05),FPN1、GPX4蛋白表达的平均荧光强度明显变强(P<0.05)。与DFO组相比,BYHWDS组神经元细胞中的Fe~(2+)含量明显下降(P<0.01),MDA含量减少(P<0.05),GSH、ROS含量无明显差异(P>0.05);蛋白印记实验显示:Tf R1、DMT1、FPN1、GPX4蛋白表达水平均无明显差异(P>0.05);免疫荧光实验显示:Tf R1、DMT1、FPN1、GPX4蛋白的平均荧光强度均无明显差异(P>0.05)。小结:补阳还五汤可通过降低缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞中蛋白Tf R1、DMT1表达水平,增强FPN1、GPX4的表达,降低细胞中的Fe~(2+)含量,减少细胞中ROS、MDA的产生,从而抑制铁死亡,减轻OGD/R 22细胞损伤,促进神经功能恢复。结论:1.大鼠MCAO/R模型制备过程中缺血侧脑血流量下降百分比在41%～50%之间模型效果最佳,MCAO/R模型成功率高、重复性及稳定性好。2.补阳还五汤可以通过降低脑组织中蛋白Tf R1、DMT1的表达,增强FPN1、GPX4的表达,降低大鼠缺血再灌注侧半暗带区脑组织中的铁离子含量,抑制了因过量铁参与芬顿反应产生的活性氧及随后的有毒脂质过氧化物蓄积引起的铁死亡,减轻CIRI,促进脑组织神经功能的恢复。3.补阳还五汤可通过降低缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞中蛋白Tf R1、DMT1表达水平,增强FPN1、GPX4的表达,降低细胞中的Fe~(2+)含量,减少细胞中ROS、MDA的产生,从而抑制铁死亡,减轻OGD/R模型HT22细胞损伤,促进神经功能恢复。

【目的】研究黑老虎果实发育及种子油脂积累规Compound C作用律，可为其果实发育期的栽培管理和种子油脂的开发利用提供理论基础。【方法】观测黑老虎果实发育的8个不同时期果实和种子表型、横纵径、形状指数；并利用索氏抽提法、激光共聚焦显微镜观察法和气相色谱法，观测种子含油量、油体形状和分布、脂肪酸组分。【结果】黑老虎果实发育Panobinostat配制期为110天左右，发育期分为青果期（14～56 DAF）、转色期（56～84 DAF）、红果期（84～112 DAF）3个阶段（DAF：花后天数）。果实和种子的横纵径、质量生长曲线均呈单“S”型变化规律，符合Logistic回归模型，决定系数高达0.967 2～0.998 6。14～98 DAF为果实生长期，横纵径和质量快速Receiving medical therapy增加，成熟时果实横径为115.99 mm、纵径为105.65 mm、单果质量为526.08 g;14～84 DAF为种子生长期，成熟时黑老虎种子横径为12.38 mm、纵径为14.26 mm、种子百粒质量为47.85 g。种子油脂积累规律呈“慢—快—慢”变化，青果期积累缓慢、转色期快速积累、红果期积累减缓，油脂积累方程为y=56.261 2·(1+e~(6.582 1-0.102t))~(-1)。黑老虎种子油体呈圆球形，随着种子发育逐渐体积变大、数量增多逐渐充满整个细胞。油脂积累过程中共检出16种脂肪酸，以棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸为主，其中亚油酸含量最高。成熟的黑老虎种子含油量高达55.51 g·(100g)~(-1)，不饱和脂肪酸占比77.10%，亚油酸相对含量为66.88%，属于优质的植物油脂。【结论】黑老虎果实发育规律、种子油脂积累规律均符合Logistic回归模型，Logistic方程能反映果实发育和油脂积累情况，对果实生产具有重要的指导意义。黑老虎种子含油量高、油体形状规则、油脂品质好，其作为植物食用油具有巨大的潜力和开发价值。

目的 探讨重组人白细胞介素-11(rhIL-11)对恶性实体瘤患者化疗所致血小板减少症（CIT）一级预防的有效性和安全性。方法 采用随机数字表法将88例恶性实体瘤化疗患者分为观察组和对照组，每组44例，观察组患者应用rhIL-11一级预防CIT，对照组患者应用安慰剂。比较两组患者CIT发生率、血小板（PLT）变化情况、化疗相关不良事件发生情况、PLT输注情况、rhIL-11相关不良反应发生情况。结果 一级预防后，两组患者CIT总发生率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；观察组患者Ⅲ～Ⅳ级CIT发生率为2.27%，低于对照组患者的18.18%，差异有统计学意义（P<0.05）。化疗第14、20天，观察组患者PLT水平均高于对照组（P<0.05）。至化疗第20天selleck合成，观察组患者化疗相关不良事件总发生率为11.36%，低于对照组患者的29.55%，差异有统计学意义MRTX849试剂（P<0.05）；两组患者PLT输注率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。应用rhIL-11后，观察组5例患者出现了轻微的不良反应，对症治疗后症状消失，未停用rhIL-11。结论 应用rhIL-11对恶性实体瘤CIT高出血风险和有危险因素的中出血风险人群进行一级预防，可减轻CIT严重程度，减少化疗相关不良事件，rhIL-11相关不良反应轻cancer cell biology且易纠正，建议应用于临床。

研究背景与目的:免疫系统是机体识别、清除外源性有害物质与保护机体自身、维持体内稳态的重要系统。根据免疫反应的特异性,免疫系统被分成先天性免疫系统与适应性免疫系统两大分支。先天性免疫系统来自于机体自身所具有的免疫功能。先天性免疫系统包括机体的物理屏障、生物体内的生物活性分子和先天性免疫细胞。先天性免疫系统能够对于入侵的病原体微生物、机体损伤释放产物、异常状态的细胞产生免疫反应,达到防御感染与维持机体稳态的效果。适应性免疫系统依赖于后天机体免疫系统发展而来。适应性免疫系统主要包括抗原提呈细胞和T、B淋巴细胞。适应性免疫反应涉及抗原提呈细胞和T、B淋巴细胞之间严格调节的相互作用,通过基因片段重排产生具有特定抗原受体的T、B淋巴细胞,产生抗原特异性的免疫反应。免疫系统功能失调与多种疾病的发生与发展密切相关,调节免疫系统功能能够取得治疗作用。在器官移植中,器官移植受体免疫系统对于移植器官的识别与攻击会导致移植物的功能受损,并最终导致移植物被排斥,完全丧失功能。针对移植器官的免疫排斥反应是受体免疫系统识别供体来源的抗原,激活先天性免疫系统和适应性免疫系统而产生的急性和慢性排斥反应。另一类与免疫系统密切相关的疾病类型是自身免疫性疾病。自身免疫性疾病是一种免疫系统针对宿主自身细胞、组织和器官产生慢性免疫反应,最终导致组织结构破坏、功能障碍和病理性改变的疾病。自身免疫反应导致机体组织损伤的机制与移植免疫排斥类似,都是机体免疫系统对自身抗原产生过度免疫反应后,免疫系统攻击表达自身抗原的正常组织细胞,导致组织结构破坏,功能异常。移植免疫排斥和自身免疫性疾病的治疗的关键是抑制免疫反应,诱导免疫耐受。虽然当前的免疫抑制策略在移植免疫排斥与自身免疫性疾病的治疗中取得了一定的效果,但是仍然存在许多毒副作用与应用局限性。因此,开发新的诱导免疫耐受的策略对于移植免疫排斥与自身免疫性疾病的治疗极为重要。纳米医学是将纳米技术应用于医学领域,赋予药物独特的生物学效应,提高疾病的预防、诊断、治疗和康复效果的一门新兴的科学技术。纳米药物能够通过将药物分子吸附于材料表面或包裹于材料内部等方式,高效地运载各种药物分子,将药物分子靶向递送至特定部位,实现高效递送药物分子此网站的目的。与传统药物相比,纳米药物递送系统具有许多独特的优势,例如提高药物利用率与稳定性、提高药物靶向性、降低毒副作用等。纳米药物的发展为调节免疫反应、抑制移植免疫排斥和治疗自身免疫性疾病提供了许多新策略,具有广泛的应用前景。本研究的目的是探索利用纳米颗粒作为药物递送载体诱导免疫耐受用于治疗移植免疫排斥和自身免疫性疾病。利用纳米药物载体,靶向多器官组织中DC和巨噬细胞递送CD40 siRNA,抑制DC和巨噬细胞的分化和活化,从而抑制移植受体体内免疫排斥反应,延长移植物的存活时间;靶向心脏组织递送免疫抑制剂(tacrolimusNervous and immune system communication),增强在靶器官局部微环境的免疫抑制性,抑制心脏组织浸润T细胞的活化,提高自身免疫性疾病的治疗效果。我们通过基于纳米药物载体的不同药物递送策略,研究调控全身抗原提呈细胞功能和组织局部T细胞活化的作用,探究抑制免疫反应治疗免疫相关疾病的效果与机制。研究方法:首先,我们通过双乳化法制备包载CD40 siRNA的载药纳米颗粒(siCD40/NPs),利用粒度仪对siCD40/NPs进行表征。通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜对尾静脉注射后siCD40/NPs在小鼠体内的分布进行分析。随后我们通过流式细胞术检测小鼠尾静脉注射siCD40/NPs后DC和巨噬细胞CD40的表达。我们进一步利用流式细胞术检测了siCD40/NPs在小鼠DC和巨噬细胞的前体细胞中的分布。随后我们利用流式细胞术和qPCR检测siCD40/NPs对于小鼠骨髓诱导DC和巨噬细胞的影响。我们利用编码CD40 shRNA的慢病毒载体验证降低CD40对于DC和巨噬细胞分化的影响。我们在小鼠同种异基因皮肤移植模型中验证了siCD40/NPs抑制移植免疫排斥反应,延长小鼠同种异基因皮肤移植物存活时间的效果。其次,我们通过薄膜水化法制备获得4种PEG末端修饰不同化学基团的脂质纳米颗粒(LNP-Met、LNP-Ami、LNP-Car、LNP-Mal),利用粒度仪对LNP进行表征。我们通过扫描电子显微镜对LNP形貌进行了观察。在尾静脉注射DiD荧光标记的LNP后,我们通过小动物成像和激光共聚焦显微镜对LNP在小鼠心脏与其他主要脏器中的分布进行分析。我们进一步分析了尾静脉注射后不同时间点LNP-Mal和马来酰亚胺修饰比例不同的LNP-Mal在小鼠心脏中的分布。我们通过流式细胞术和激光共聚焦对LNP-Mal在小鼠心肌细胞中的分布。我们利用免疫荧光检测尾静脉注射LNP-Mal/mRFP后小鼠心肌组织中RFP的表达。我们在小鼠自身免疫性心肌炎模型中检测了LNP-Mal/Tac抑制小鼠自身免疫性心肌炎症反应,保护小鼠心肌组织的效果。我们进一步通过流式细胞术检测了LNPMal/Tac对于小鼠T细胞增殖的影响。研究结果:我们通过双乳化法制备获得了包载CD40 siRNA的siCD40/NPs。尾静脉注射后,siCD40/NPs能够将siRNA递送至小鼠DC和巨噬细胞中。siCD40/NPs能显著降低脾脏DC和巨噬细胞中CD40的表达,并显著降低脾脏中DC和巨噬细胞的比例和数量。我们进一步发现siCD40/NPs能够将siRNA递送至小鼠DC和巨噬细胞的造血干细胞和前体细胞中。小鼠骨髓诱导DC和巨噬细胞实验表明siCD40/NPs能够抑制DC和巨噬细胞的分化,并且抑制DC和巨噬细胞的活化。慢病毒载体验证结果表明,降低CD40的表达能够抑制DC和巨噬细胞的分化与成熟。在小鼠同种异基因皮肤移植模型中,siCD40/NPs能够抑制移植免疫排斥反应,显著延长小鼠同种异基因皮肤移植物存活时间。我们通过薄膜水化法制备获得了4种不同末端PEG修饰的LNP。在尾静脉注射后,LNP-Mal在小鼠心脏中的分布明显高于其他修饰的LNP。尾静脉给药后,虽然小动物成像结果显示给药后小鼠心脏荧光信号随时间逐渐减弱,但是CLSM观察结果表明小鼠心肌组织中DiD荧光信号随时间逐渐增强。随着马来酰亚胺修饰比例升高,,小鼠心肌组织中DiD荧光信号分布逐渐分散。尾静脉注射后LNP-Mal能够进入小鼠心肌组织中,并且能够被小鼠心肌细胞所摄取。LNPMal/mRFP能够将RFP mRNA递送至小鼠心肌细胞中并表达。在小鼠自身免疫性心肌炎模型中,LNP-Mal/Tac能够抑制小鼠自身免疫性心肌炎症反应,保护小鼠心肌组织,抑制小鼠心脏病理性扩张。LNP-Mal/Tac能够通过提高心肌组织中tacrolimus的浓度抑制心肌组织浸润T细胞的功能。研究结论:首先,我们的研究结果表明siCD40/NPs能够降低体内多器官中DC和巨噬细胞的CD40表达,同时能够沉默骨髓造血干细Apoptosis抑制剂胞和髓系前体细胞中CD40表达,从而抑制了DC和巨噬细胞的分化与成熟。因此,静脉注射的siCD40/NPs能够高效降低抗原提呈细胞诱导T细胞活化的效果,从而增强移植受体的免疫耐受水平,延长小鼠同种异基因皮肤移植物的存活时间。进一步,我们发现PEG末端的马来酰亚胺修饰能够提高尾静脉注射的LNP在心脏中的富集。LNP-Mal分布于小鼠心肌细胞和细胞外基质中。因此,利用LNP-Mal能够向心肌细胞递送RFP mRNA并成功表达RFP蛋白。在低剂量tacrolimus水平下,LNP-Mal/Tac显著增强了心肌组织微环境的免疫抑制水平,有效抑制小鼠自身免疫性心肌炎炎症反应,保护小鼠心肌组织和心脏功能。我们的研究结果证明纳米药物载体能够通过调控全身免疫细胞功能和建立局部组织内免疫抑制微环境,实现抑制免疫反应、诱导免疫耐受的效果,为相关疾病的治疗提供了新策略和新方法。

目的:本研究旨在探讨柚皮素对急性视网膜缺血/再灌注(Ischemia/reperVeterinary medical diagnosticsfusion,I/R)模型和慢性高眼压(Ocular hypertensive,OHT)模型的视网膜神经保护作用以及可能存在的机制。为预防和(或)治疗包括青光眼在内的,以神经炎症为关键发病因素的相关疾病提供一种新的药物/膳食补充剂以及提供潜在的治疗靶点。方法:本研究以6-8周的雄性C57BL/6小鼠为实验对象。通过高压灌注提高小鼠右眼的眼内压(Intra-ocular pressure,IOP),持续1小时后停止灌注,以建立右侧急性视网膜I/R损伤。慢性OHT模型则是通过往小鼠的右眼前房注射微珠来建立。在两个模型中,左眼均为自身对照(Control,CON)。实验期间分别给予溶剂、低浓度(100 mg/kg/day)或高浓度(300 mg/kg/day)的柚皮素(Naringenin,NAR)进行口服灌胃。按照有无造模和给药的不同,分为CON组:CON+溶剂、CON+100 NAR、CON+300 NAR;实验组:I/R(或OHT)+溶剂、I/R(或OHT)+100 NAR、I/R(或OHT)+300 NAR。采用苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色、具有多重剪接的RNA结合蛋白(RNA-binding protein with multiple splicing,RBPMS)和神经胶质酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫荧光染色来评估I/R模型和OHT模型的视网膜损伤程度。采用蛋白质免疫印迹法(Western blotting,WB)检测GFAP、CD38、Sirtuin1(SIRT1)和nod样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)的表达水平来探讨其作用机制。结果:在OHT模型中,微珠能诱导右眼的IOP升高,在长期的IOP监测当中,高浓度和低浓度的柚皮素均体现出降低IOP的效果,但在累积的IPD-0332991使用方法OP的对比中,只有高浓度的柚皮素体现了显著的作用。在I/R模型和OHT模型中,损伤后小鼠的视网膜神经节细胞层(Ganglion cell layer,GCL)厚度变薄、GCL中的细胞和RBPMS标记的视网膜神经节细胞(Retinal ganglial cells,RGCs)数量AMG510分子式明显减少。高浓度柚皮素能抑制I/R模型和OHT模型中GCL视网膜厚度的变薄和细胞数量的减少,并且可降低损伤诱导的全视网膜RGCs的丢失。低浓度柚皮素也能改善I/R模型中的外周视网膜RGCs的丢失。与此同时,高浓度的柚皮素还能明显抑制视网膜中星型胶质细胞的活化和降低视网膜中GFAP蛋白的表达。并且高浓度柚皮素可抑制由I/R模型和OHT模型中,损伤诱导的视网膜NLRP3和CD38蛋白的高表达,同时上调SIRT1蛋白的表达。结论:本研究首次发现柚皮素可降低微珠诱导的IOP升高,为柚皮素应用在青光眼治疗中提供了新思路。柚皮素对I/R模型和OHT模型中,损伤造成的GCL的厚度变薄、GCL中细胞数量降低和RGCs数量明显减少具有保护作用。其作用机制可能通过抑制视网膜星型胶质细胞活化和介导CD38/SIRT1信号通路达到了抗炎作用。因此,柚皮素可能是一种潜在的预防和治疗青光眼的药物/膳食补充剂。

水稻(Oryza sativa)是世界上主要的粮食作物之一,粮食需求量日益增长,提高水稻产量对于应对全球人口的增长至关重要。到目前为止,在模式植物中发现了大量的保持绿色突变体,出现功能性延绿表型是增产增效的突破口之一。植物应对胁迫时发生许多生理变化,植物激素在调控植物生长和胁迫反应中起着重要作用。茉莉酸(JA)是一种存在于高等植物中的内源生长调节物质,也是众所周知的衰老诱导剂。衰老过程由相关转录因子激活或抑制,AP2/ERF作为植物特有的转录因子家族之一,在植物生命周期中参与许多不同的胁迫过程,研究功能主要集中于非生物胁迫的应答,对于ERF类转录因子如何提高作物产量的研究极少。本研究前期为了探索响应茉莉酸信号的分子机制,参考其他转录组数据分析筛选到OsDERF8转录因子,克隆OsDERF8并构建水稻遗传材料,通过黑暗诱导衰老和自然衰老方式,探究OsDERF8功能。OsDERF8影响叶片衰老进程,并解析相关分子机制。结果如下:1.通过qRT-PCR分析在不同处理下转录因子OsDERF8的表达模式;生物信息学分析发现OsDERF8转录因子与水稻中的OsERF101聚为一簇,亲缘关系最近,该基因被报道参与JA介导的叶片衰老进程;氨基酸序列分析显示OsDERF8与ERF家族基因一致具有保守的AP2结构域;利用水稻原生质体亚细胞定位实验确定转录因子OsDERF8定位于细胞核。2.水稻品种ZH11为背景构建了OsDERF8稳定过表达(OsDERF8-OE)和CRISPRCas9敲除株系(Osderf8-ko),培育筛选至纯合;苗期黑暗处理,实验结果表明离体叶盘OsDERF8过表达叶片提前黄化,Osderf8突变体叶片黄化时间晚于ZH11,Osderf8突变体具有较高的叶绿素含量和较完整的叶绿体结构;在自然环境衰老中,OsDERF8过表达表现出株型矮小,生育期缩短,产量降低;但Osderf8突变体叶片光合时间延长,籽粒饱满,产量提升。3.RNA-Seq分析,在Osderf8突变体中叶绿素降解和衰老相关基因显著下降,为衰老负调控因子;光合获悉更多相关基因表达显著上调,表明Osderf8突变体保持较高的叶绿素含量和光合能力;激素相关基因也大量富集,尤其为JA信号和合成基因,通过RT-q PCR对转录组数据部分基因进行验证。Promoter-LUC实验明确OsDERF8可以激活衰老标志基因(acute hepatic encephalopathyOsNAP、Osl85)和叶绿素降解基因(OsNYC1、OsPAO)基因启动子,表明OsDERF8可能通过调节此类基因的转录水平进而调控叶片衰老。4.转录因子OsDERF8影响水稻株型与根系发育,与ZH11相比Osderf8突变体根系发达,OsDERF8过表达根系发育受到抑制;OsDER8过表达在生殖发育期叶角增大。以上进程除了JA信号外可能有多种激素参与,例如RNA-Seq数据中生长素和细胞分裂素相关基因富集。5.OsDERF8功能与JA信号相关,Osderf8突变体对JA低敏。水稻原生质体中瞬时过表达JA核心转录因子OsMYC2,发现OsDERF8的表达上调;通过Promoter-LUC实验和Y1H实验明确OsMYC2间接调控OsDERF8的转录,表明水稻生长发育过程中转录因子OsDERF8在叶片衰老、根系发育等进程发挥重要作用,与JA信号密不可S63845分子式分。本研究发现OsDERF8正调控JA介导的叶片衰老进程,突变后可延缓叶片衰老,从而提高了水稻的产量,本研究为进一步挖掘了JA信号调控网络,对水稻选育具有重要的理论价值,也为优良品种的选育提供科学依据。