油菜是人类食用油和饲用蛋白质的重要来源,是继大豆之后最重要的油料作物。菜籽饼粕作为动物饲料具有良好的营养价值;然而,菜籽饼粕中的硫代葡萄糖苷(简称“硫苷”)对饲养动物具有毒害作用,大大降低了菜籽饼粕的饲用价值。另一方面,硫苷在人类的癌症预防、植物病虫害防御和赋予蔬菜特殊风味等方面具有多种积极作用。因此,精准调控硫苷在油菜体内的分布,特别是在降低有害硫苷的同时提高有益硫苷的含量,对提升油菜抗性和利用价值具有重要意义。本研究以甘蓝型油菜自然群体为基本材料,基于前期的全基因组重测序和发育中种子(花后20天和40天;20DAF和40DAF)转录组测序数据,通过GWAS(Genome-Wide Association Studies)和TWAS(Trancriptome-Wide Association Studies)相结合的方法,分析了甘蓝型油菜种子硫苷积累的遗传基础,并对其中一个编码油菜硫苷转运蛋白的候选基因BnaC02.GTR2及其上游转录因子BnaA02.STOCalanopia mediaP2的生物学功能开展了系统的研究,获得的主要研究结果如下:1.GWAS结合TWAS解析种子硫苷含量的遗传基础及BnGTR2的功能研究结合关联群体连续三年的种子硫苷含量性状,利用GWAS分析定位了15个稳定的种子硫苷含量QTL位点。利用加权基因共表达网络分析,和集成了多组学数据并基于机器学习的POCKET算法来挖掘关键模块和候选PCI-32765分子式基因。结果表明,位于q GSL.C02.1位点的基因BnaC02.GTR2(BnaC02g42260D)是调控油菜种子硫苷积累过程中的一个关键基因。利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,证明BnaC02.GTR2及其3个同源基因正调控油菜种子硫苷积累。与野生型相比,Bngtr2的种子显著变小、种子含油量显著升高并。进一步对BnaC02.GTR2与TWAS中的种子硫苷含量显著关联基因进行了表达量相关性分析,以及对BnaC02.GTR2和TWAS鉴定的种子发育相关基因进行了共表达网络分析,发现BnaC02.GTR2与多种生物学过程有关,如蛋白质积累、氨基酸合成、硫苷合成、糖同化和胚胎发育等。另一方面,对BnaC02.gtr2与野生型在开花后20天的种子进行了转录组测序分析,鉴定到了1234个差异表达基因,其中与硫苷合成和转运相关的基因表达量明显降低。此外,差异表达基因在多个种子发育相关的生物学过程中得到了富集。说明BnaC02.GTR2不仅参与了甘蓝型油菜种子硫苷的积累,而且参与了甘蓝型油菜种子发育的多个过程。2.BnaA02.STOP2是BnaC02.GTR2的上游转录因子对BnaC02.GTR2启动序列进行保守基序分析和结合转录因子预测,根据这些保守基序预测到了30个可能结合的转录因子,并通过酵JNJ-42756493母单杂交实验和凝胶阻滞实验验证了BnaA02.STOP2特异性结合BnaC02.GTR2启动子。在Bnstop2 T_1代纯合六基因突变体中,硫苷转运蛋白GTR2的油菜同源基因BnGTR2,其A02拷贝在根中表达量显著下调。而在叶片中,BnGTR2的A06、C02和C03拷贝表达量也显著下调。表明BnSTOP2可能在根和叶片中对硫苷合成和转运关键基因的表达进行调控。3.BnSTOP2调控油菜种子硫苷含量且多层次参与油菜体内的硫代谢过程在Bnstop2 T_2代纯合突变体中,开花后20天根组织的硫代谢基因集和半胱氨酸、甲硫氨酸代谢基因集的表达均呈下调趋势。相应的KEGG通路注释也展示了BnSTOP2的突变对硫代谢过程的多个层次,包括硫酸盐转运、硫酸盐同化、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢都有显著变化。在生理生化分析层面,Bnstop2 T_2代突变体中根和角果的谷胱甘肽含量均显著减少;种子的硫苷含量显著降低了48.87%;种子的贮藏蛋白含量显著减少了22.66%,表现为总硫库的整体减少。进一步对突变体和野生型材料进行苗期叶片菌核病抗性鉴定,结果表明,突变体叶片的菌核病抗病性显著降低,这与总硫库减少的趋势一致。在互作蛋白分析层面,以BnaA02.STOP2作为诱饵蛋白进行酵母双杂交文库筛选,筛选到了在硫代谢不同层次的调控因子与BnaA02.STOP2相互作用,表明BnaA02.STOP2可能通过与其他蛋白形成调控复合体的形式参与硫代谢和硫苷代谢不同层次的转录调控。上述研究结果证明了BnaC02.GTR2是调控油菜种子硫苷积累和种子发育的一个重要基因,并揭示了其上游转录因子BnaA02.STOP2在油菜硫代谢和硫苷转运调控中的生物学功能,为优化硫苷在油菜体内的分配,创制营养器官高硫苷而种子更低硫苷的新种质奠定了较好的基础。