目的:甲状腺癌(thyroid cancer,TC)是最常见的内分泌系统恶性肿瘤,随着甲状腺癌总体发病率的增加,晚期甲状腺癌的发病率和死亡率均呈上升趋势。肿瘤耐药是改善晚期甲状腺癌患者预后的主要障碍。Lenvatinib是一种口服、多靶向酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKI),能对不同组织学病理亚型的甲状腺癌患者发挥抗肿瘤活性,但用药不良事件的频繁发生和肿瘤耐药的出现限制了患者临床获益的最大化。BRAF作为丝裂原活化蛋Dolutegravir IC50白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号级联通路的核心组成成分,与多种药物治疗抵抗密切相关。BRAF突变是甲状腺癌中最常见的分子事件,能够激活下游的细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信号通路,促进肿瘤发生、增殖、分化和生存,维持甲状腺癌的恶性表型。本文通过构建人甲状腺癌Lenvatinib耐药细胞系,旨在分析人甲状腺癌中Lenvatinib耐药的原因,探讨了BRAF突变调控ARNTL参与Lenvatinib耐药的机制,并寻找可能的克服Lenvatinib耐药的小分子药物,为Lenvatinib进一步的临床应用提供参考,从而改善晚期甲状腺癌患者的预后。方法:首先选取KTC-1和8505C两种人甲状腺癌细胞系,通过梯度增加持续刺激的药物浓度构建耐药细胞系。利用转录组测序及TCGA数据库生信分析可能参与耐药的分子及通路。利用CCK-8实验、平板克隆实验检测药物浓度、BRAF及ARNTL表达水平对细胞增殖的影响。利用ROS、MDA、GSSG/GSH试剂盒检测药物、BRAF及ARNTL表达水平对细胞内氧化应激水平的影响。利用小干扰RNA(si RNA)、质粒、慢病毒构建BRAF、ARNTL、CREB干扰/过表达细胞系。利用q RT-PCR和Western Blot检测BRAF、ARNTL、CREB基因的转染效率、细胞系中BRAF、ARNTL、CREB基因间的调控作用及小分子药物对凋亡/铁死亡相关蛋白的表达影响。利用双荧光素酶报告基因和CHIP实验验证CREB与ARNTL启动子的结合作用及转录调控作用,以及BRAF对这种调控作用的影响。利用流式细胞术检测细胞内ROS水平及药物对细胞凋亡水平的影响。利用透射电镜观察药物耐药细胞发生铁死亡的超微细胞结构改变。利用荧光显微镜观察细胞内ROS和脂质过氧化物的改变。利用裸鼠成瘤实验检测了体内BRAF突变细胞系中ARNTL的表达水平对Lenvatinib药物敏感性的影响。结果:成功构建了KTC-1-R和8505C-R两种人甲状腺癌Lenvatinib耐药细胞系。耐药株KTC-1-R和8505C-R相比于亲本株KTC-1和8505C能够明显抵抗Lenvatinib的肿瘤抑制作用。高通量测序分析发现MAPK/ERK信号通路与肿瘤Lenvatinib耐药密切相关,由于BRAF突变对ERK信号通路的激活作用,BRAF突变可能参与甲状腺癌Lenvatinib耐药。功能富集分析发现甲状腺癌Lenvatinib耐药与细胞内氧化还原、ROS代谢等反映细胞氧化应激水平的通路相关。比较耐药细胞株与亲本细胞株细胞内ROS、MDA、GSSG/GSH水平发现耐药细胞株相对于亲本细胞株具有较高的氧化应激水平和抗氧化能力。BRAF突变状态能改变细胞内氧化应激水平进而影响细胞对Lenvatinib的敏感性。TCGA数据库分析ARNTL在BRAF突变样本中高表达,且与临床侵袭特性相关。ARNTL在耐药细胞株中高表达,并通过发挥抗氧化作用参与调控甲状腺癌Lenvatinib耐药。干扰ARNTL后,细胞内ROS水平明显增加,对Lenvatinib的敏感性增强;过表达ARNTL后,细胞内ROS水平明显下selleckchem降,细胞增强对Lenvatinib对耐药。BRAF突变可上调ARNTL的表达,促进其发挥抗氧化作用,进而参与Lenvatinib耐药。BRAF突变通过激活p-ERK,促进CREB核内磷酸化,从而上调ARNTL的表达。CREB能够与ARNTL启动子结合,激活转录调控,促进其表达;干扰BRAF后能抑制CREB对ARNTL的启动子的激活作用。BRAF突变质粒的插入可以促进ARNTL介导的Lenvatinib耐药,共转染si-CREB后减弱了对Lenvatinib的耐药。体内BRAF突变细胞系中,Lenvatinib对耐药细胞株的肿瘤抑制作用明显低于亲本细胞株,干扰ARNTL表达后细胞对Lenvatinib的药物敏感性增加,过表达ARNTL后,细胞对Lenvatinib的药物敏感性减弱。小分子药物筛选发现,Vitamin C能显著抑制人甲状腺癌Lenvatinib耐药细胞的增殖。Vitainfectious ventriculitismin C通过抑制p-ERK通路抑制ARNTL的表达,并显著增加耐药细胞株细胞内ROS水平,进而诱导耐药细胞死亡。Vitamin C能够显著增加耐药细胞株的凋亡比例,并影响凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-7和BCL-2的表达下降,以及Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-7的表达升高。Vitamin C能够诱导细胞铁死亡,表现为细胞内线粒体内嵴皱缩,线粒体膜断裂,细胞内脂质过氧化物水平增加,并下调铁死亡抑制相关蛋白Nrf2、SLC7A11、GPX4的表达水平。Vitamin C与Lenvatinib联合应用能有效抑制甲状腺癌Lenvatinib耐药细胞的活力。结论:成功构建人甲状腺癌Lenvatinib耐药细胞系后发现,BRAF突变通过激活p-ERK促进CREB的核内磷酸化,CREB与ARNTL启动子结合促进ARNTL表达发挥抗氧化作用,参与甲状腺癌Lenvatinib耐药;Vitamin C通过p-ERK抑制ARNTL的表达,显著增加耐药细胞株细胞内ROS水平,诱导耐药细胞株发生凋亡/铁死亡克服Lenvatinib耐药。