研究背景急性肾损伤(Acute Kidney Injury,AKI)是临床上常见的急危重症,可发展为慢性肾病(Chronic Kidney Disease,CKD)甚至终末期肾脏病(End Stage Renal Disease,ESRD),临床预后差。在肾癌(Kidney Cancer,KC)的临床治疗中,经过肾癌部分切除术或者肾癌根治术的患者会因为肾单位的丢失导致肾脏功能的下降,甚至引起急性肾损伤的发生。目前,对于急性肾损伤发生发展分子机制的探索缺乏突破性的进展,单细胞RNA测序(Single-cell RNA sequencing,sc RNA-seq)技术的出现给大多数疾病的分子机制研究带来了福音,它能够以高分辨率的测序手段展现每个细胞的基因表达特征,进而揭示疾病更丰满的面貌。我们通过对单细胞转录组测序数据的分析,筛选出急性肾损伤及随后纤维化中的关键分子CCAAT增强子结合蛋白Delta(CCAAT Enhancer Binding Protein Delta,CEBPD)。CEBPD是属于CEBP蛋白家族的一种转录因子,其参与能量代谢、细胞增殖分化、免疫、炎症、纤维化以及肿瘤等多种生理及病理过程。现已报道斑马鱼的肾脏中CEBPD的表达水平在其心脏组织损伤后的再生过程中能够被远程诱导上调。此外,也有研究指出CEBPD与纤维化疾病密切相关,其参与肝纤维化、中枢神经纤维化以及心脏纤维化的病理进程。尽管如此,CEBPD在急性肾损伤及随后纤维化中的生物学功能及分子机制尚不清楚。研究目的1.利用sc RNA-seq构建SD大鼠急性肾损伤的单细胞转录组图谱,鉴定并表征不同类型的细胞。2.筛选急性肾损伤及纤维化中的关键分子CEBPD,分析CEBPD与肾癌术后相关急性肾损伤的关联。3.研究CEBPD在急性肾损伤及随后纤维化中的生物学作用以及分子调控机制。研究方法1.利用双侧肾动脉夹闭法(30分钟)构建缺血再灌注SD大鼠急性肾损伤模型,模型分成4组,包括对照假手术组、48小时组、4周组以及6周组,每组3只大鼠。通过检测模型大鼠的血清尿素氮和血清肌酐以及模型大鼠肾脏的苏木精-伊红(HE)染色和天狼星红染色验证模型建立的有效性。2.将SD大鼠急性肾损伤模型的肾脏标本制作成单细胞悬液并进行测序,使用R软件对单细胞数据进行质控以及降维聚类,并通过特征性基因对各类细胞进行鉴定。分别从基因表达、通路激活以及拟时序轨迹的角度,探究急性肾损伤中各种细胞亚群的分子、通路以及分化等改变。通过Cellchat算法分析细胞亚群之间的通讯与联系。3.将先前本课题组的人肾癌癌旁组织样本的单细胞数据及本研究的SD大鼠急性肾损伤模型样本的单细胞数据进行联合分析,通过两组单细胞数据的转录因子分析数据筛选出急性肾损伤及纤维化中的关键转录因子CEBPD。通过免疫组化microbiome establishment实验检测SD大鼠急性肾损伤模型的各组样本中CEBPD的蛋白表达水平。4.收集临床上行肾部分切除术的218例T1期肾癌患者的癌旁组织样本,并根据术中热缺血时间将患者分为A(热缺血时间<25分钟)、B(热缺血时间≥25分钟)两组,统计两组病人术前1天至术后三天的血清肌酐指标并进行分析。利用免疫组化实验检测A、B两组病人癌旁组织样本中KIM-1(Kidney injury molecule 1,肾损伤分子1selleckchem AM-2282)以及CEBPD的蛋白表达水平并进行统计分析。5.构建人正常近端肾小管上皮HK2细胞的缺氧/复氧细胞模型以及缺氧/复氧后诱导纤维化细胞模型作为模拟急性肾损伤及随后纤维化的体外实验模型。使用CCK-8细胞活力检测实验检测两种细胞模型以及野生型HK2细胞的细胞活力。运用蛋白免疫印迹技术检测两种细胞模型以及野生型HK2细胞中CEBPD的蛋白表达水平。通过构建CEBPD敲减细胞模型、药物诱导实验、脂质活性氧检测、丙二醛检测、亚铁离子检测、还原型谷胱甘肽检测来探索CEBPD在急性肾损伤及随后纤维化中参与的细胞死亡方式。6.利用HK2细胞中CEBPD的Ch IP-seq数据、Ch IP-seq公共数据库中CEBPD相关数据、铁死亡数据库以及本课题SD大鼠急性肾损伤单细胞数据筛选CEBPD在急性肾损伤及随后纤维化中潜在的下游靶点。并通过实时荧光定量PCR、双荧光素酶报告实验等方法验证CEBPD与筛选的下游靶点的相关性。最后通过基因集富集分析、实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹实验探索CEBPD在急性肾损伤及随后纤维化中的分子调控机制。研究结果1.模型大鼠的血清尿素氮及血清肌酐检测结果以及HE染色和天狼星红染色实验结果提示,本项目的缺血再灌注SD大鼠急性肾损伤模型构建成功,且模型中4周组和6周组的肾脏样本发生了急性肾损伤后纤维化改变。2.对SD大鼠急性肾损伤模型样本的单细胞数据进行质控,共计得到57366个细胞,并构建急性肾损伤单细胞转录组图谱。于图谱上总计鉴定出31个细胞亚群,并主要鉴定表征了近端肾小管上皮细胞的7类细胞亚群,其中近端肾小管上皮S3段细胞亚群(PTS3)、近端肾小管损伤上皮细胞亚群(Injury)以及近端肾小管修复上皮细胞亚群(Recovery)在急性肾损伤及随后纤维化修复中扮演着重要的角色。3.通过联合分析人肾癌癌旁组织样本单细胞数据及SD大鼠急性肾损伤模型样本单细胞数据,于两组单细胞数据的转录Wnt-C59试剂因子分析结果中筛选出急性肾损伤及随后纤维化的关键转录因子CEBPD。免疫组化实验结果提示,在SD大鼠急性肾损伤模型样本中,48小时组、4周组以及6周组相对于对照假手术组,CEBPD的抗体染色程度更深,阳性细胞数量更高,说明48小时组、4周组以及6周组中CEBPD的蛋白表达水平相对于对照假手术组更高。4.行肾部分切除术的218例T1期肾癌患者中,A组病人(热缺血时间<25分钟)术前1天至术后3天血清肌酐增幅与B组病人(热缺血时间≥25分钟)相比有明显差异,B组病人术前1天至术后3天血清肌酐增幅水平更高,更容易发生术后急性肾损伤。A、B两组病人的癌旁组织样本的免疫组化实验结果提示,B组中KIM-1及CEBPD的蛋白表达水平相对于A组更高。免疫组化评分统计结果说明,218例肾癌病人癌旁组织中CEBPD的表达水平与KIM-1的表达水平成正相关。5.蛋白免疫印迹检测结果提示,HK2细胞缺氧/复氧细胞模型以及缺氧/复氧后诱导纤维化细胞模型中CEBPD的蛋白表达水平相对于对照野生型HK2细胞明显升高。细胞活力检测实验证明敲减CEBPD能够挽救两组细胞模型相对于对照组细胞模型的细胞活力减弱的结果。药物诱导实验、脂质活性氧检测、丙二醛检测、亚铁离子检测、还原型谷胱甘肽检测等结果提示CEBPD在缺血再灌注急性肾损伤及随后纤维化中参与不依赖亚铁离子的铁死亡过程。6.将HK2细胞中CEBPD的Ch IP-seq数据、Ch IP-seq公共数据库中CEBPD相关数据与铁死亡数据库求交集,共得到12个交集基因,并在SD大鼠急性肾损伤单细胞数据的近端肾小管上皮细胞亚群中分析CEBPD与上述交集基因的相关性,筛选出CEBPD下游潜在靶点激活转录因子3(Activating Transcription Factor 3,ATF3)。实时荧光定量PCR、双荧光素酶报告实验的结果提示,CEBPD能够与ATF3启动子区域结合并促进其转录及表达。基因集富集分析、实时荧光定量PCR以及蛋白免疫印迹实验证明CEBPD在急性肾损伤及随后纤维化中能够通过ATF3/SLC7A11/GPX4途径促进细胞铁死亡。研究结论本项研究构建了缺血再灌注SD大鼠急性肾损伤模型并绘制了急性肾损伤单细胞转录组图谱,鉴定与表征了不同类型的细胞。筛选出了急性肾损伤及随后纤维化中的关键分子CEBPD,并明确CEBPD的表达与行肾部分切肾癌患者的术中热缺血时间、肾功能损伤程度以及发生急性肾损伤的风险密切相关。最后体外基础实验证明CEBPD在急性肾损伤及纤维化中靶向ATF3,并通过调控ATF3/SLC7A11/GPX4途径促进细胞铁死亡。