随着科学技术的快速发展,核相关技术在生产生活中被广泛地应用,人们暴露于电离辐射(ionizing radiation,IR)的风险也越来越大。骨髓(bone marrow,BM)是人体内对电离辐射最敏感也是最主要的靶器官之一,大于1 Gy的射线照射就能使骨髓出现明显的造血异常,而更大剂量的放射暴露甚至会导致造血功能衰竭。已有大量的研究表明,造血干细胞(Hematopoietic stem cell,HSC)的稳态失衡是中重度以上骨髓放射损伤的根本原因,同Ferrostatin-1体外时放射损伤后造血干细胞DNA突变的累积明显增加了白血病,尤其是髓系白血病的发生率。因此,探索如何调控造血干细胞的稳态对于中重度放射损伤及白血病的救治具有重要的临床价值。造血干细胞是血液系统中具有持续自我更新和分化能力的一类特殊细胞。造血干细胞具有异质性,根据其长期造血重建能力的强弱可进一步分为长期造血干细胞(long-term HSC,LT-HSC),短期造血干细胞(short-term HSC,ST-HSC)和多潜能祖细胞(multipotent progenitor,MPP)。正常情况下,绝大多数长期造血干细胞都处于静止(即G0期)的细胞周期状态,造血干细胞的这个特性是维持造血干/祖细胞(Hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs)池稳定的主要原因之一。最近,越来越多的学者认为,造血干细胞的细胞周期状态不仅与其稳态调控密切相关,在骨髓放射损伤后造血重建的过程中也具有重要作用。近年来,尽管多种关键调控因子和信号通路被发现参与到造血干细胞的稳态调控中,但细胞周期调节在其中所扮演的角色及机制尚未被完全阐明,需要更进一步地探索。细胞周期依赖性激酶19(cyclin dependent kinase 19,CDK19)是CDK蛋白家族中的重要成员之一,由于与CDK8具有高度的序列相似性,因此又被称为CDK8L/CDC2L6/Cdk11等。在细胞核内,CDK8/19通过与MED12,MED13和cyclin C组成转录中间复合体(transcriptional mediator complex,TMC)参与调控细胞应激应答、机体生长发育和神经系统功能等。最近有研究发现,CDK8/19在乳腺癌、前列腺癌及结肠癌等肿瘤中表达显著增高,同时与癌症的发展及转归存在密切相关性。另外,有文献报道CDK8/19在调控人大肠癌细胞增殖及应激反应中也扮演了重要角色,然而它们在造血系统中是否具有类似的作用尚未被报道。通过数据库和预实验结果,我们观察到在骨髓造血干细胞中CDK19的表达明显增高,且这种富集在电离辐射后更加明显,因此我们推测CDK19可能参与到了造血干细胞的稳态调控并且在放射应激损伤中发挥了重要作用。在本研究中,我们主要在稳态和应激条件下对CDK19调控造血干细胞的作用及分子机制进行探究,并利用急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞系进行了验证。我们首先利用定量PCR检测CDK19在稳态与应激条件下小鼠骨髓造血干/祖细胞中表达情况;随后对CDK19~(-/-)小鼠体内骨髓造血干/祖细胞的比例、细胞周期和凋亡等情况进行流式检测及分析;更为重要的是,我们通过竞争性骨髓移植,反向移植和归巢实验等明确了CDK19缺失对造血干细胞长期重建能力的影响;同时构建骨髓放射损伤模型,观察在辐射应激条件下CDK19对造血干细胞的作用;此外,我们利用转录组芯片、免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)、染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)等技术进一步研究了CDK19在调控骨髓造血干细胞稳态和功能中的具体分子机制;最后,我们在HL-60及NB-4两种白血病细胞系中对CDK19的作用和机制进行了验证。主要研究结果及结论如下:1.CDK19是维持造血干细胞增殖能力的重要因子1.1数据库和定量PCR结果均显示,小鼠骨髓造血干细胞中CDK19的表达明显增高。CDK8/19抑制剂(Senexin B)处理后显著减缓造血干细胞的扩增并抑制其集落形成;而CDK19过表达能够促进造血干细胞增殖并显著增强其长期造血重建能力。综上,CDK19可能对维持造血干细胞的增殖能力具有重要作用。1.2流式细胞术检测发现,CDK19敲除小鼠体内造血干细胞及其亚群的比例和数量均显著降低;Ki67和Brd U染色显示CDK19敲除后造血干细胞退出静止能力明显减弱,而凋亡水平并没有明显改变。这些结果表明CDK19可能通过维持造血干细胞增殖实现造血干细胞池的动态平衡。2.CDK19促进应激条件下造血功能的恢复2.1在小鼠放射损伤模型中,CDK19敲除小鼠对射线更加敏感,且外周血成熟细胞和骨髓造血干细胞的恢复速度明显减慢,此外,CDK19缺失的造血干细胞在辐照后凋亡水平显著增加;另一方面,5-氟尿嘧啶(5-FluPhysio-biochemical traitsorouracil,5-FU)处理明显降低了CDK19敲除小鼠的生存率并显著延迟其外周血细胞数量的恢复。以上结果说明,CDK19对应激条件下骨髓造血功能的恢复具有促进作用,这可能是由于CDK19维持造血干细胞的增殖能力所致。2.2竞争性骨髓移植和转染(过表达CDK19)后移植等实验证实CDK19对于维持造血干细胞的长期造血重建能力至关重要。2.3归巢实验和反向骨髓移植等实验表明CDK19是通过内在性的方式维持了骨髓造血干细胞的长期造血重建能力。3.CDK19通过p53-p21信号通路调控造血干细胞的增殖和自我更新能力3.1全基因转录组芯片结果提示,CDK19敲除后造血干细胞中静止相关特征明显富集,细胞周期进程明显被抑制,同时p53信号通路显著活化。3.2进一步实验证实,CDK19缺失造血干细胞中p53的m RNA及蛋白表达水平均无明显改变,而p21的表达水平显著增加;过表达CDK19后造血干细胞中p21表达水平显著降低。这些结果提示在造血干细胞中CDK19参与调控p21的表达水平。3.3 IP和Ch IP-PCR结果证实,CDK19可以直接与p53结合于p21的启动子区域从而影响p21的转录过程。这表明CDK19敲除小鼠骨髓造血干细胞的增殖和自我更新能力显著降低可能归因于p53通路活化后p21的表达增加。3.4 p53抑制剂(Pifithrin-β,PFTβ)处理显著降低CDK19~(-/-)小鼠造血干细胞中p53和p21的表达水平,并显著增加骨髓中造血干细胞的数量,增强其退出静止的能力。更为重要的是,PFTβ的处理能够显著改善CDK19缺失所导致造血干细胞长期重建能力的缺陷。这些结果提示CDK19通过调控p53-p21通路维持造血干细胞的增殖和自我更新能力。4.CDK19是保留急性髓系白血病细胞增殖能力的关键分子4.1数据库结果显示在急性髓系白血病中CDK19与细胞周期进程密切相关。定量PCR结果显示CDK19在白血病细胞系HL-60和NB-4点击此处细胞中表达显著增加。Senexin B可以显著抑制HL-60和NB-4细胞的增殖能力。以上结果提示CDK19可能在急性髓系白血病细胞的增殖过程中发挥了重要作用。4.2定量PCR结果发现,Senexin B处理的HL-60和NB-4细胞中p53表达水平无显著变化,而p21表达水平显著增加。基因表达分析发现在急性髓系白血病中CDK19与p53的表达水平无明显相关,而与p21的表达水平具有负相关性。这些结果提示CDK19可以通过p53-p21通路调控急性髓系白血病细胞的增殖能力。总之,本研究通过对CDK19在稳态和应激条件下造血作用的系统研究,揭示了CDK19是一个能够参与到骨髓造血干细胞及急性髓系白血病细胞周期调控的重要分子,也发现了CDK19在辐射应激条件下能够促进骨髓造血功能的恢复,这些结果不但丰富了对造血干细胞稳态调节网络的认识,同时也为电离辐射所致骨髓造血功能损伤及急性髓系白血病的救治提供了一定的指导。