一、研究背景及目的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC,以下简称为肝癌)是全球癌症死亡的第三大原因,具有早期诊断率低,术后易复发和转移率高等特点。虽然近年来在外科手术和药物治疗方面取得了极大进展,但大多数肝癌患者预后并未得到明显改善,五年生存率仅为15%。免疫治疗已在多种癌症治疗中展示出了强大的抗肿瘤活性,比如PD-1/PD-L1抗体对晚期黑色素瘤和非小细胞肺癌患者疗效显著。目前的免疫疗法主要是靶向肿瘤微环境中CD8~+T细胞,通过激活或增强其肿瘤杀伤能力达到抑制肿瘤的效果。但令人失望的是,免疫治疗仅对一小部分肝癌患者有效,且随着治疗时间的延长,大多数患者病情仍然会逐步进展。究其原因,一方面是因为肿瘤细胞可以不断进化演变逃避免疫识别;另一方面,肿瘤细胞可以通过重塑微环境抑制CD8~+T细胞的浸润和功能,比如通过募集调节性T细胞(Treg)和骨髓来源抑制细胞(MDSCs)抑制CD8~+T细胞功能,从而加速肿瘤的进展。因此,深入研究肝癌细胞调控T细胞免疫的分子机制,发现药物治疗新靶点,对于改善肝癌免疫治疗效果有着重要的临床意义和社会价值。全基因组CRISPR/Cas9文库筛选技术已成功应用于体外或体内实验,以识别不同类型肿瘤的共同生存必须基因和特定癌症类型的依赖性生存基因。通过结合临床治疗药物或抗肿瘤免疫细胞,如索拉非尼或CD8~+T细胞等,可筛选出对这些药物耐受或敏感的关键基因,为癌症治疗提供了重要的理论依据和特异性靶标。然而,体外的细胞筛选模型缺乏完整的免疫微环境,无法有效筛选调控免疫微环境的关键基因。本课题中我们利用CRISPR/Cas9文库筛选技术和生物信息学分析,基于3种具有不同免疫背景的小鼠模型:野生型免疫健全C57BL/6J小鼠(wild type,WT)、T细胞免疫缺失小鼠(Rag1~(null))和重度免疫缺陷鼠(NSG),系统地筛选了肝癌中调控T细胞免疫的候选基因,并结合临床样本和体内外实验对关键基因的调控作用和分子机制进行探索,以望为肝癌的免疫治疗提供新靶标。二、研究方法1.利用Cas9慢病毒感染Hepa1-6细胞,构建稳定表达Cas9的细胞株,随后以鼠源Ge CKO v2文库感染Hepa1-6稳转细胞系,经过嘌呤霉素筛选后,皮下接种于WT、Rag1~(null)和NSG三种具有不同免疫背景的小鼠。14天后收集瘤体组织,提取并利用PCR扩增基因组DNA进行深度测序,通过MAGe CKFlute算selleck Torin 1法进行差异基因的筛选,得到可能调控肝癌T细胞免疫的基因。2.结合GEO和TCGA公共数据库的肝癌转录组表达谱数据和临床预后数据,对候选基因进一步筛选,得到与T细胞介导的抗肿瘤免疫反应显著正相关(Pearson coefficient>0.5,P<0.05),且在肝癌患者中差异表达并对预后有明显影响的潜在关键基因(P<0.05)。3.利用GEO公共数据库中的肝癌单细胞转录组数据(GSE149614),分析潜在关键基因腺苷酸环化酶7(ADCY7)对肝癌免疫微环境的影响。4.利用构建的含有155对肝癌组织和对应癌旁组织的芯片队列验证ADCY7蛋白在肝癌中的表达水平、对患者预后的影响以及与CD3~+T、CD8~+T细胞浸润的关系。5.利用慢病毒构建稳定过表达ADCY7的细胞株,检测ADCY7对肝癌细胞增殖的影响;分离健康人外周血CD8~+T细胞,分别与对照或过表达ADCY7的肝癌细胞共培养,通过Transwell迁移实验检测ADCY7对CD8~+T细胞迁移能力的影响。6.利用对照或过表达ADCY7的肝癌细胞构建小鼠荷瘤模型,通过免疫组化和流式实验检测AEpimedii HerbaDCY7对肝癌生长和免疫微环境的影响,明确ADCY7在肝癌T细胞免疫调控中的重要作用。7.利用GEO公共数据库中肝癌数据集进行KEGG,GO和GSEA富集分析,探索ADCY7影响的关键信号通路;利用q PCR和免疫印迹实验检测ADCY7对富集通路中关键基因CCL5表达的影响。8.利用免疫组化、细胞组分蛋白分离(细胞膜、细胞质和细胞核)和免疫印迹实验检测ADCY7蛋白在肝癌组织和细胞内的定位;使用染色质免疫共沉淀实验检测ADCY7与CCL5基因上游启动子区域结合情况;在免疫健全小鼠和免疫系统人源化小鼠皮下荷瘤探究CCL5在ADCY7发挥抗肿瘤免疫反应中的重要性。9.利用免疫共沉淀实验、细胞组分分离(细胞膜、细胞质和细胞核)和核转运蛋白抑制剂等,探索ADCY7蛋白从细胞膜向细胞核移位的分子机制。10.利用超速离心方法分离过表达ADCY7肝癌细胞和对照组细胞分泌的外泌体(分别命名为OE-exo和NC-exo),通过透射电子显微镜、纳米颗粒追踪分析、液相色谱-串联质谱法和免疫印迹实验进行验证ADCY7是否存在于外泌体中。11.将肿瘤细胞分别与NC-exo和OE-exo进行共培养,利用免疫荧光实验验证外泌体ADCY7能否进入肿瘤细胞。12.利用鼠源肝癌细胞Hepa1-6构建小鼠荷瘤模型,通过瘤内注射外泌体NC-exo和OE-exo验证外泌体ADCY7对肝癌生长的影响;利用流式实验和免疫组化验证外泌体ADCY7对肝癌免疫微环境的影响,明确外泌体ADCY7在肝癌免疫调控中的重要作用。13.通过TCGA和GEO公共数据库肝癌数据集探索影响ADCY7表达的潜在原因和潜在的治疗药物,利用q PCR和免疫印迹实验验证ADCY7在肝癌细胞中的表达是否受潜在治疗药物的影响;利用Hepa1-6细胞构建小鼠皮下荷瘤模型,探索潜在治疗药物联合PD-1治疗是否能够显著抑制肝癌的进展。三、研究结果本课题的第一部分是对全基因组CRISPR/Cas9基因敲除文库筛选得到的测序数据进行生物信息学分析,以初步确定参与调控Lorlatinib肝癌T细胞免疫的关键基因。我们在WT、Rag1~(null)和NSG三种具有不同免疫背景的小鼠模型中进行体内全基因组CRISPR筛选,并利用MAGe CKFlute算法初步筛选出潜在关键基因。然后结合已经报道的T细胞浸润以及T细胞介导的抗肿瘤免疫反应相关基因集、TCGA和GEO公共数据库中肝癌转录组数据和生存预后数据,筛选出了关键基因ADCY7。进一步通过肝癌组织芯片队列验证了ADCY7蛋白在肝癌组织中低表达,且提示较差的患者预后。随后利用肝癌公共单细胞转录组数据(GSE149614)发现ADCY7与CD8~+T细胞的肿瘤浸润联系密切,并且在肝癌组织芯片中也证实ADCY7蛋白表达水平与细胞毒性CD8~+T细胞浸润高度正相关。与对照细胞相比,ADCY7过表达后肝癌细胞本身的增殖能力并未受到明显影响;ADCY7过表达细胞能够吸引更多的CD8~+T细胞迁移。体内动物实验结果表明在重度免疫缺陷鼠中ADCY7过表达并不影响肝癌的生长,但在免疫健全小鼠中ADCY7过表达可以显著抑制肝癌的生长,且肿瘤内CD8~+T细胞浸润和杀伤功能显著增高,但其他免疫细胞如CD4~+T细胞和NK细胞等浸润水平无明显变化。这些结果提示ADCY7主要通过参与调控肝癌免疫微环境中CD8~+T细胞浸润和杀伤能力,抑制肿瘤进展。本课题的第二部分是ADCY7调控肝癌T细胞免疫的分子机制研究。我们首先通过肝癌公共转录组数据进行KEGG,GO和GSEA富集分析,结果表明ADCY7高表达组与趋化因子通路显著相关。我们发现ADCY7可以正向调控趋化因子通路关键基因CCL5 m RNA和蛋白的表达。体内实验证实CCL5是ADCY7发挥抗肿瘤免疫反应的关键影响因素。机制上,ADCY7通过小窝蛋白介导的内吞途径从细胞膜进入细胞质中,随后在内质网蛋白LRRC59以及核转运蛋白的协助下,完成细胞核移位,并在细胞核内与转录因子CEBPA相互作用,结合CCL5基因上游启动子区域促进其转录,进而募集大量CD8~+T细胞浸润。另外,通过免疫印迹和液相质谱等实验证明了ADCY7蛋白存在于肿瘤细胞分泌的外泌体中,外泌体ADCY7能够进入肿瘤细胞并促进CCL5的表达。在临床应用探索方面,我们发现高表达ADCY7外泌体注射能够通过促进CCL5表达募集更多的CD8~+T细胞浸润并增强其杀伤功能,显著抑制肝癌细胞的体内生长。此外,我们还发现ADCY7在肝癌中低表达与其基因高甲基化和组蛋白去乙酰化等表观遗传修饰有关,且表观遗传药物地西他滨(甲基化抑制剂)和vorinostat(组蛋白去乙酰化酶抑制剂)可以明显提高肝癌细胞ADCY7表达水平,且vorinostat联合PD-1治疗展示出更强的肝癌抑制作用。四、结论本研究通过体内全基因组CRISPR筛选鉴定出调控肝癌T细胞免疫的关键分子ADCY7。ADCY7能够以小窝蛋白介导的内吞方式从细胞膜进入细胞质,再依赖于内质网蛋白LRRC59和核转运蛋白KPNB1进入细胞核,并在细胞核内作为转录因子CEBPA的辅因子结合CCL5上游启动子区域,正向调控CCL5基因的转录,进而促进CD8~+T细胞浸润。同时ADCY7能够以外泌体的形式分泌出去,进入肿瘤细胞中促进CCL5表达,抑制肝癌进展。综上所述,ADCY7在肝癌免疫微环境调控中发挥着重要的调控作用,是肝癌治疗的潜在靶点。