第一部分兔膝关节置换模型中ES-PMMA骨水泥对炎性因子表达水平的作用聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥(Polymethylmethacrylate,PMMA)是一种常用且十分重要的植入性耗材,已广泛应用于临床各类骨科手术,它由固体粉剂和液体组成,使用时再将两者混合。其在固化前有一定程度的可塑性和黏性,可填充在复杂的手术部位,固化后起到支撑和黏合作用,并承受一定载荷。骨水泥操作简便,固定可靠且不易松动,常用来治疗骨质疏松造成的椎体压缩骨折和关节置换术中的假体固定。研究表明,在人工膝关节置换术中,骨水泥植入后易产生血压下降、心率增快及氧分压降低等一系列症状,引发骨水泥植入综合征(bone cement implantation syndrome,BCIS)。生理状态下,细胞当中的抗炎因子和促炎因子处于平衡状态,但当存在手术等创伤刺激后,特别是关节置换等骨科大手术,则会诱导环氧化酶-2(COX-2)表达和前列腺素释放,并激活前列腺素受体。前列腺素能增加炎症细胞中环磷酸腺苷的浓度,从而增加促炎性因子如:白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)等分泌,抑制抗炎因子白细胞介素-10(IL-10)的合成,引发炎性反应。此外,白细胞介素-17(IL-17)主要由辅助性T细胞(Th17)分泌,也是机体重要的促炎性细胞因子,而IL-10主要由调节性T细胞(Treg)分泌,是机体重要的抗炎细胞因子,二者共同调控机体免疫反应和炎症反应的平衡。课题组前期的研究表明,依诺肝素钠-聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥(以下简称ES-PMMA骨水泥),作为一种改进的新型材料,在实验室中,将依诺肝素钠粉剂与骨水泥固态粉剂人工混合后,可较好地保持原有骨水泥的强度和刚度。同时,依诺肝素钠能够从骨水泥中有效释放出来,并发挥其应有的药物活性。众所周知,在临床上低分子肝素应用于血栓性疾病和体外抗凝治疗已有近百年的历史。然而,肝素具Medical organization有多效性,可参与调节免疫应答和炎性反应,其中的分子机制及药理学作用引起了学者们的广泛关注,而依诺肝素钠作为低分子肝素的一种也应有相同的药效。本次实验我们利用ES-PMMA骨水泥良好的释放特性,探索依诺肝素钠在兔膝关节置换模型中对炎性因子表达水平的作用。目的:通过利用ES-PMMA骨水泥良好的释放特性,探讨其在膝关节置换动物模型中对局部炎性因子的作用。方法:选取新西兰兔建立膝关节置换模型,共40只,随机分为四组:传统PMMA骨水泥组、ES-PMMA骨水泥组、假手术组及空白对照组,每组10只。在手术植入相应骨水泥后的第30、60、90分钟,传统PMMA骨水泥组、ES-PMMA骨水泥组取切口内黏有骨水泥的局部组织,假手术组和空白对照组取相同部位组织。应用免疫组化病理学方法,检测术区局部组织中炎性因子IL-17A、IL-6、IL-1β和TNF-α的表达情况。结果:免疫组化结果表明,IL-17A阳性细胞表达在传统PMMA骨水泥组、ES-PMMA骨水泥组、假手术组和空白对照组中,60分钟时ES-PMMA骨水泥组阳性细胞表达增多,但明显少于传统PMMA骨水泥组;假手术组在90分钟时视野中阳性细胞最多。IL-6阳性细胞表达集中在组织间隙内,ES-PMMA骨水泥组IL-6表达各时间点均少于传统PMMA组和假手术组。IL-1β在传统PMMA骨水泥组、假手术组30分钟时表达最多,ES-PMMA组30分钟明显少于两者。TNF-α阳性细胞表达传统PMMA骨水泥组、假手术组30分钟时两组无明显差异,ES-PMMA组阳性细胞数明显少于传统PMMA组和假手术组。小结:1.兔膝关节置换模型可作为成熟的动物模型,模拟手术局部炎性环境,进行宏观实验。2.在兔膝关节置换模型中,ES-PMMA骨水泥植入后可通过释放依诺肝素钠,降低术区局部组织中炎性因子IL-17A/IL-6/IL-1β/TNF-α的表达水平。第二部分ES-PMMA骨水泥影响脂多糖(LPS)诱导的内皮细胞凋亡机制的实验研究全膝关节置换术所导致的炎性反应可引起诸多并发症,而这与炎性因子的增加有着密切联系,在动物实验中我们已经发现ES-PMMA骨水泥对膝关节置换术中的局部炎性因子分泌有抑制作用,可调节局部炎性微环境。而在实际的膝关节置换术中,由于骨水泥植入后可在肺动脉监测到血栓形成,可能是因PMMA骨水泥聚合反应,导致大量的热量释放所致。其反应过程中,由于释放热量导致刺激局部组织,进而激活机体凝血系统,产生的微血栓可造成肺栓塞。经前期研究结果证实,因手术本身刺激激活了凝血系统引发术区存在高凝血状态。同时,当灌注骨水泥并打入假体时,髓腔内压力在短时间内迅速升高,微血栓被挤压至循环系统中,导致肺栓塞等严重并发症。但这些微血栓的形成是否与局部炎性微环境的改变存在联系目前并无报道。在对血栓及其相关疾病的研究中,内皮细胞损伤是讨论的热点问题之一。内皮细胞损伤引起内皮下胶原暴露,激活凝血系统,诱发血小板聚集、活化,这是产生血栓的必要条件之一。膝关节置换手术由于局部组织破坏及骨水泥的植入,造成血管内皮细胞损伤,激活了凝血系统,导致血栓形成。此外,内皮细胞损伤后同时释放炎性因Dibutyryl-cAMP子,产生炎性反应并改变炎性微环境。而炎性因子和血栓形成之间存在密切联系,因此我们选择了内皮细胞作为进一步研究的对象,从体外实验中继续讨论ES-PMMA骨水泥发挥抗炎作用的机制。膝关节置换手术创伤大,疼痛剧烈,机体因为应激反应导致炎性反应增加,特别是IL-6,TNF-α等炎性因子水平升高。结果可引发Ⅳ型超敏反应,其机理主要是效应T细胞、巨噬细胞和白细胞渗透到假体植入部位,并通过改变炎性微环境,诱发局部炎性反应,损伤周围组织。在细胞实验中我们发现,ES-PMMA骨水泥作为一种新型材料,通过对炎性因子的抑制作用,可显著降低内皮细胞凋亡率,而内皮细胞凋亡及坏死减少后,局部炎性环境得到改善,血管内皮下胶原暴露机会也会随之减少,可有效降低血栓性疾病的发生率,这也进一步说明了ES-PMMA骨水泥具有一定的抗炎特性。目的:通过建立LPS诱导的内皮细胞凋亡模型,探讨ES-PMMA骨水泥抑制炎性因子的表达并影响内皮细胞凋亡的机制。方法:骨水泥的制备同动物实验,将制备好的骨水泥液相混匀后放入1cm*1cm*1cm模具中固化待用,试件使用PD-0332991细胞培养前经高压蒸汽灭菌处理。预实验采用MTT法筛选出LPS最佳的诱导浓度,并进行细胞毒性检测;以最适浓度的LPS模拟内皮细胞凋亡模型。实验分为四组:空白对照组、LPS诱导组、PMMA+LPS组和ES-PMMA+LPS组。采用流式细胞学技术检测内皮细胞凋亡情况;Elisa和蛋白印迹法(Western Blot)、细胞免疫荧光法分别检测细胞培养液中IL-6、TNF-α、IL-10和细胞间黏附分子(ICAM)的含量及相关蛋白表达水平。结果:MTT法筛选LPS浓度为100mg/ml时,24小时细胞存活率最大,达80%,随着时间延长,细胞存活率显著降低,确定实验中诱导浓度为100mg/ml。流式细胞术及Elisa检测细胞上清液结果:与空白对照组比较,LPS诱导组IL-6,TNF-α和ICAM的含量增多(P<0.001),IL-10含量减少(P<0.001),凋亡率升高(P<0.001);ES-PMMA+LPS组较LPS诱导组IL-6,TNF-α和ICAM的含量减少(P<0.05),IL-10含量增多(P<0.05),凋亡率降低(P<0.001)。此外,Western blot、免疫荧光结果提示:IL-6、TNF-α和ICAM蛋白表达LPS诱导组较空白对照组上调(P<0.001),平均荧光强度升高(P<0.001),IL-10蛋白表达下调(P<0.001),平均荧光强度降低(P<0.001);ES-PMMA+LPS组较LPS诱导组和PMMA+LPS组IL-6,TNF-α和ICAM蛋白表达均下调(P<0.05、P<0.01、P<0.001),IL-10蛋白表达上调(P<0.001);ES-PMMA+LPS组较LPS诱导组IL-6,TNF-α和ICAM平均荧光强度降低(P<0.001),IL-10平均荧光强度增加(P<0.01)。小结:1.在LPS诱导的内皮细胞凋亡模型中,ES-PMMA骨水泥可抑制IL-6、TNF-α和ICAM蛋白表达,减少炎性反应。2.ES-PMMA骨水泥可通过提高抗炎因子IL-10蛋白表达水平,发挥抗炎作用。3.ES-PMMA骨水泥可降低内皮细胞凋亡率,其机制与调节促炎因子的相关蛋白表达有关。第三部分ES-PMMA骨水泥对巨噬细胞极化的影响及在内皮细胞和巨噬细胞共培养中发挥抗炎作用的实验研究巨噬细胞常用于维持体内平衡及抵抗病原体入侵。其通过抗原提呈和吞噬作用,广泛参与机体免疫反应,是体内固有的免疫细胞。巨噬细胞的极化反应是其参与炎性反应过程的显著特征之一,也是在微环境中受到不同刺激因素发挥作用的基础。巨噬细胞可根据表面标志物及细胞因子不同分为两种主要类型:包括M1型巨噬细胞(classical activated M1-type macrophages)即经典活化型,M2型巨噬细胞(alternatively activated M2-type macrophages)即替代活化型。促炎性因子主要由M1型分泌,并参与炎性反应及组织损伤;抗炎性因子主要由M2型分泌,抵抗炎性反应并进行组织修复。抗炎反应和组织修复之间的表型转变决定了炎性反应的最终结局。当机体受到有害刺激时,巨噬细胞经历M1型极化,蛋白标志物CD16/32,CD64,CD80,CD86等分子的表达增多,诱导局部炎症反应和促炎性巨噬细胞产生;M2型特征为蛋白标志物CD10,CD163,CD206及精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1)等分子高表达,可促进组织修复。巨噬细胞的极化机制较多,其中包括TLR4/NF-κB、MAPK、AKT2、STAT1等与M1型有关,STAT3/6、AKT1、PPAR-γ与M2型有关。巨噬细胞在不同组织中会根据所处环境的不同而产生极化。脂多糖(LPS)是一种微生物成分,可以催动巨噬细胞向M1表型极化。如前所述,M1型巨噬细胞能够诱导产生促炎性相关因子,如白介素家族及肿瘤坏死因子(TNF)家族。相比之下,M2型巨噬细胞则具有抗炎反应及组织修复的能力。在炎症的演变过程中,巨噬细胞会先产生促炎性的M1表型,帮助宿主对抗病原体。随后,巨噬细胞逐渐向M2表型转变,形成抗炎反应,并修复受损组织。由于巨噬细胞在调节机体免疫反应、组织代谢中有着不可或缺的作用,若巨噬细胞极化紊乱可能会引发一系列疾病。有效分析巨噬细胞极化障碍的机制和过程,对疾病的诊疗大有帮助。内皮细胞和巨噬细胞密切参与炎症的病理过程。内皮细胞可触发巨噬细胞的选择性生长、分化和功能极化。在本部分实验中,我们通过检测巨噬细胞的极化趋势并建立了内皮细胞和巨噬细胞的共培养模型,对共培养中内皮细胞凋亡率和炎性因子表达水平进行分析,发现与传统PMMA骨水泥相比,ES-PMMA骨水泥可促进巨噬细胞M2极化,并通过减少共培养模型中炎性因子的表达降低内皮细胞的凋亡率。目的:通过检测细胞培养液中巨噬细胞的极化趋势和共培养模型中炎性因子表达和内皮细胞凋亡率,进一步探究ES-PMMA骨水泥的抗炎机制。方法:骨水泥试件、筛选细胞培养液浓度同第二部分。实验同样分为四组:LPS诱导组、PMMA+LPS组、ES-PMMA+LPS及空白对照组。使用流式细胞术检测巨噬细胞极化和共培养体系中内皮细胞凋亡情况。Elisa、Western Blot、细胞免疫荧光法分别检测共培养体系中IL-6、TNF-α、IL-10和细胞间黏附分子(ICAM)的含量和相关蛋白表达水平。结果:1.巨噬细胞相关蛋白CD86表达水平LPS诱导组较空白对照组上调(P<0.01),ES-PMMA+LPS组表达水平下调(P<0.05);CD206表达水平LPS诱导组较空白对照组下调(P<0.001),ES-PMMA+LPS组表达水平上调(P<0.01)。2.内皮细胞和巨噬细胞共培养体系中,LPS诱导组较空白对照组细胞凋亡率明显上升(P<0.001),ES-PMMA+LPS诱导组较LPS诱导组细胞凋亡率明显下降(P<0.001)。Elisa检测上清液中的IL-6、TNF-α和ICAM含量LPS诱导组较空白对照组增多(P<0.001),IL-10含量降低(P<0.001);ES-PMMA+LPS诱导组较LPS诱导组上述细胞因子含量降低(P<0.01或P<0.05),IL-10含量增多(P<0.05)。3.Western Blot和免疫荧光结果显示IL-6、TNF-α和ICAM蛋白表达LPS诱导组较空白对照组上调(P<0.001),平均荧光强度增加(P<0.001);IL-10表达下调(P<0.001),平均荧光强度降低(P<0.001);ES-PMMA+LPS组较LPS诱导组和PMMA+LPS组IL-6、TNF-α和ICAM蛋白表达下调(P<0.05或P<0.01),IL-10表达上调(P<0.001);ES-PMMA+LPS组较LPS诱导组IL-6、TNF-α和ICAM平均荧光强度降低(P<0.001),IL-10平均荧光强度增加(P<0.001)。小结:1.ES-PMMA骨水泥通过释放依诺肝素钠可调节巨噬细胞特异性蛋白CD86和CD206的表达,减少巨噬细胞M1极化,并促进M2极化,减少炎症反应。2.在巨噬细胞和内皮细胞的共培养体系中,ES-PMMA骨水泥可降低内皮细胞的凋亡率,其机制与减少促炎因子IL-6和TNF-α表达有关。3.ES-PMMA骨水泥可降低细胞间黏附分子ICAM蛋白表达,可抑制因内皮细胞损伤后的巨噬细胞黏附趋势,抑制炎症反应进一步加剧。4.ES-PMMA骨水泥提高了共培养体系中抗炎因子IL-10蛋白表达水平,进一步验证了第二部分的实验结果。结论:1.兔膝关节置换模型可作为成熟的动物模型,模拟手术局部炎性环境。在动物实验中,改良的ES-PMMA骨水泥植入后可通过释放依诺肝素钠,降低术区局部组织中炎性因子IL-17A/IL-6/IL-1β/TNF-α的分泌水平。2.在LPS诱导的内皮细胞凋亡模型及巨噬细胞和内皮细胞共培养体系中,ES-PMMA骨水泥可抑制促炎性因子IL-6、TNF-α和ICAM蛋白表达,提高抗炎性因子IL-10表达水平,减少炎性反应,发挥抗炎作用。3.ES-PMMA骨水泥可通过释放依诺肝素钠,干预巨噬细胞特征性蛋白CD86及CD206的表达,调节其M1/M2表型极化方向,从而减少炎性反应。4.在体外实验中,ES-PMMA骨水泥均可降低内皮细胞的凋亡率,其机制与调节炎性因子的相关蛋白表达有关。5.ES-PMMA骨水泥通过降低细胞间黏附分子ICAM蛋白表达,抑制因内皮细胞损伤后的巨噬细胞黏附趋势,防止炎性反应进一步加剧。6.改良的ES-PMMA骨水泥同样也会引起局部炎性反应,但较传统PMMA骨水泥产生的炎性反应小,说明依诺肝素钠具有一定抗炎作用。