胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)由前胰高血糖素原翻译后加工生成。GLP-1受体属于G蛋白耦联受体家族,广泛分布于中枢神经系统,在调节摄食行为、能量代谢、抑郁、焦虑、突触可塑性等方面发挥重要的生理功能。海马体是大脑边缘系统的一个关键组成部分,其中海马CA1和CA3两个区域有密切纤维联系,参与学习、记忆和认知过程。以往研究表明,GLP-1受体广泛分布在海马CA1和CA3区锥体神经元,且在小鼠的海马体中过度表达GLP-1受体可以改善学习和记忆。近期有实验表明,给予GLP-1受体激动剂可增加下丘脑弓状核等核团神经元的自发放电活动。然而,迄今为止,GLP-1对海马CA1和CA3区神经元中自发放电活动的调控及其机制仍未了解。目的:1.观察外源性GLP-1受体激动剂exendin-4对海马CA1和CA3区神经元自发放电的调控。2.观察内源性GLP-1对海马CA1和CA3区神经元自发放电的调控。3.观察GLP-1对海马神经元自发放电调控的受体和离子通道机制。4.观察海马CA1和CA3区神经元GLPchronic suppurative otitis media-1受体的表达。方法:本实验采用在体细胞外电生理记录及多管微电极压力注射给药技术观察海马CA1和CA3区神经元的自发放电活动;采用免疫组织化学技术观察CA1和CA3区神经元GLP-1受体的表达。结果:1.外源性GLP-1受体激动剂exendin-4增加海马CA1区神经元自发放电频率。在大鼠海马CA1区记录的27个神经元中,通过微压力注射10μM exendin-4可使其中20个神经元的自发放电频率由3.50±0.57 Hz增加至6.84±0.74 Hz(P<0.001),平均增加161.47±36.60%,较生理盐水对照组明显增强(P<0.001)。剩余7个神经元加药前后放电频率无明显变化(P>0.05)。放电模式分析显示,exendin-4对CA1区神经元自发放电的CV值无明显影响(P>0.05)。2.内源性GLP-1对海马CA1区神经元自发放电活动的影响。在海马CA1区记录的16个神经元中,单独给予特异性GLP-1受体阻断剂exendin-9-39(10μM)可使其中9个神经元的放电频率由4.09±0.75 Hz下降到1.91±0.33 Hz(P<0.001),平均降低52.48±2.23%,与生理盐水组相比明显下降(P<0.001)。而在剩余7个神经元,微压力注射exendin-9-39后没有改变其自发放电频率(P>0.05)。3.Exendin-4通过激活GLP-1受体兴奋海马CA1区神经元。在记录到的8个CA1区神经元中,联合给予exendin-4和exendin-9-39可使自发放电频率由3.49±0.68 Hz变化为3.48±0.47 Hz(P>0.05),平均变化8.18±10.69%,较第二次单独给予exendin-4所致的162.35±22.87%的放电频率增加有明显差异(P<0.01)。为了验证同一细胞先后两次注射exendin-4是否产生相似的效应,我们选择在同一神经元间隔相同时间先后两次给予exendin-4,第一次注射exendin-4与第二次注射exendin-4具有相似的兴奋效应(P>0.05)。4.Exendin-4通过经典瞬时受体电位(transient receptor potential canonical,TRPC)4/5通道兴奋海马CA1区神经元。通过微压力注射10μM exendin-4,选择出8个exendin-4有反应的海马CA1区神经元,放电频率平均增加111.01±13.02%。在有TRPC4/5通道阻断剂ML204存在的情况下,第二次给予exendin-4可使放电频率由3.45±0.50 Hz变化为3.75±0.49 Hz(P>0.05),平均增加12.07±8.74%,明显阻断第一次单独给予exendin-4的兴奋效应(P=0.001)。5.超极化激活环核苷酸门控(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated,HCN)通道不参与exendin-4诱发的兴奋效应。在所记录的6个exendin-4有反应神经元,放电频率平均变化100.53±11.45%。第二次联合给予ZD7288(HCN通道阻断剂)和exendin-4,放电频率由3.02±0.89 Hz变化为6.32±1.07 Hz(P<0.05),平均变化109.52±32.36%,与第一次单独给予exendin-4无明显差异(P>0.05)。6.海马CA1区神经元自发放电活动与记录的时间区间的关系。分析记录到的CA1区神经元自发放电频率以及每个电极针道记录到的神经元数量与24小时内记录的时间区间的关系。结果显示记录的时间区间与神经元自发放电频率没有明显的相关性(P>0.05)。接下来我们观察到各时间区间平均每个电极针道记录到的神经元数量存在差异(P<0.05),其中18:00–24:00与6:00–12:00(P<0.01)、18:00–24:00与12:00–18:00(P<0.05)两个ZD1839配制组别记录到的神经元数量差异显著,提示晚上18点至24点这一时间段具有自发放电的海马CA1区神经元数量较多。7.外源性GLP-1受体激动剂exendin-4增加海马CA3区神经元自发放电。在所记录的22个海马CA3区神经元中,微压力注射exendin-4(10μM)可显著兴奋其中的17个神经元,其放电频率由加药前1.74±0.36 Hz增加到3.83±0.63 Hz(P<0.001),平均升高149.67±18.94%,较生理盐水对照组相比差异显著(P<0.01)。在另外的5个海马CA3区神经元加药前后放电频率无明显变化(P>0.05)。放电模式分析显示,exendin-4对CA3区神经元自发放电的CV值无明显影响(P>0.05)。8.内源性GLP-1参与调控海马CA3区神经此网站元自发放电。在所记录的14个海马CA3区神经元中,单独给予exendin-9-39(10μM)可显著降低其中10个神经元的放电频率,由1.92±0.23 Hz降低至0.83±0.20 Hz(P<0.01),平均降低61.90±6.10%,较生理盐水组相比差异显著(P<0.01)。在另外的4个海马CA3区神经元,exendin-9-39对放电频率无明显影响(P>0.05)。9.Exendin-4通过GLP-1受体兴奋海马CA3区神经元。在所记录到的7个exendin-4有反应神经元中,放电频率平均增加111.18±16.55%。第二次联合给予exendin-4和exendin-9-39使放电频率由1.77±0.19 Hz变化至1.94±0.21 Hz(P>0.05),变化百分数为13.31±10.38%,明显阻断第一次单独给予exendin-4的兴奋效应(P<0.01)。10.海马CA1和CA3区神经元表达GLP-1受体。免疫组织化学染色结果表明,GLP-1受体主要表达在大鼠海马CA1和CA3区神经元胞体。结论:以上电生理学和形态学实验结果表明:(1)外源性GLP-1可通过GLP-1受体增加海马CA1和CA3区神经元的自发放电频率;(2)内源性GLP-1参与调节海马CA1和CA3区神经元的兴奋性;(3)TRPC4/5通道参与GLP-1受体激活诱导的CA1区神经元兴奋效应;(4)海马CA1和CA3区神经元表达GLP-1受体。本实验为进一步探讨海马内GLP-1及其受体系统可能作为学习记忆相关疾病的潜在靶点提供了一定的理论和实验依据。