研究背景:大脑由数百亿个神经元和神经胶质细胞组成,是人体生命活动的中枢,也是最复杂的器官。大脑起源于胚胎时期的神经管,经过复杂严格的分子和细胞过程逐渐成熟,是最早开始且最晚完成发育的器官之一。在皮层发育过程中,神经祖细胞的分裂与分化保证了神经元的数量,神经元迁移过程帮助神经元正确排布在皮层中,迁移后的皮层组织形成使神经元网络建立,这是神经发生新皮质发育最重要的三个过程,任何影响这三个过程的基因异常都会引起神经发育障碍。原发性遗传性小头畸形是一种以头围减小和大脑皮层发育异常为主要特征的神经发育障碍疾病,常伴有不同程度的智能障碍。巴基斯坦由于宗教和历史原因导致近亲通婚盛行,家族遗传性小头畸形等神经系统疾病高发。小头畸形被认为是干细胞增殖、神经元迁移、皮层形成、突触形成和凋亡异常等多种病理机制共同作用的结果。随着高通量测序技术的发展,越来越多关于该疾病的致病基因被发现。目前人类孟德尔遗传学数据库(OMIM)中已经收录了30个原发性遗传性小头畸形的致病基因,其中多数基因参与中心粒生物发生、纺锤体形成、DNA修复、细胞周期调控以及信号通路转导等过程,但仍有很多原发性遗传性小头畸形患者的致病基因不明。探究原发性遗传性小头畸形新致病基因不仅有助于深入了解该病的发病机制,为患者早期诊断、预后判断、遗传咨询和精准医疗提供参考依据;也有助于深刻认识神经发育过程中复杂的调控机制,为神经系统疾病开发有效干预措施或治疗手段提供新思路和靶点,为未来的临床诊疗提供更多方向。第一部分:家族遗传性小头畸形家系中GNG3 c.14del C基因突变的发现研究目的:原发性遗传性小头畸形具有家族遗传性和聚集性的特性,因此选择在该疾病高发的巴基斯坦地区挖掘、探索新致病基因。研究内容和方法:(1)在巴基斯坦地区对有小头畸形患者的近亲结婚家系进行信息收集和血样采集。(2)选取该家系中先证者、先证者父母(非患者)、先证者的生物学兄弟(同为小头畸形患者)以及先证者的生物学姐妹(非患者)共计5例DNA样本进行全外显子测序,利用生物信息学方法处理、筛选、分析测序数据,并对潜在候选基因进行Sanger测序验证。研究结果:(1)信息采集整理后发现Anti-biotic prophylaxis该家系中两名小头畸形患者均有以下临床表现:头围明显减小、严重智能障碍、癫痫、瘫痪、无自理能力以及语言功能障碍。(2)经全外显子测序、生物信息学方法分析、Sanger测序验证,我们发现两名患者均携带GNG3 c.14del C纯合突变,其父母为GNG3 c.14del C杂合突变携带者。小头畸形疾病表型与GNG3 c.14del C基因突变在家系内符合常染色体隐性遗传的孟德尔遗传定律。第二部分:GNG3 c.14del C基因突变的分子生物学意义研究目的:基于第一部分从家族遗传性小头畸形患者中发现的GNG3 c.14del C基因纯合突变,明确该突变的分子生物学意义。研究内容和方法:(1)对GNG3 c.14del C突变进行生物信息学分析,比对各物种间GNG3蛋白氨基酸序列,分析GNG3基因信息、CDS序列以及GNG3 c.14del C突变后蛋白的氨基酸序列变化。(2)应用免疫荧光染色法探究GNG3蛋白在HEK 293T细胞和HT22细胞中的定位情况;在细胞内转染带有HA tag的GNG3野生型和突变型质粒,通过Western blot和免疫荧光染色法探究突变后蛋白质的表达水平和定位情况。(3)利用CCK8、划痕实验探究敲低GNG3对HT22细胞增殖、迁移水平的影响;利用商业化钙离子荧光探针探究敲低GNG3对于GABA刺激下的神经细胞内钙离子浓度影响。研究结果:(1)GNG3 c.14del C突变属于移码突变,第14位碱基缺失突变后导致第6位氨基酸由脯氨更多酸突变成为精氨酸,并在第7位提前产生终止密码子,这使得原来75个氨基酸长度的蛋白质突变为只有6个氨基酸的截短蛋白,即GNG3p.Pro6Argfs*1。(2)GNG3蛋白定位于细胞膜和细胞质中;GNG3 c.14del C突变属于功能缺失突变,转染GNG3突变型质粒的细胞中无荧光表达信号,Western结果无条带显现。(3)敲低GNG3使HT22细胞增殖和迁移能力下降,在GABA刺激条件下神经细胞内钙离子浓度显著增加,影响了GABAb型受体信号传导过程。第三部分:GNG3蛋白对小鼠胚胎神经发育的影响研究目的:明确GNG3蛋白在小鼠胚胎神经发育过程中的作用。研究内容和方法:(1)利用Western blot和免疫荧光染色法探究GNG3蛋白在C57 BL6/J小鼠胚胎发育不同时期脑组织中的表达水平及定位情况。(2)利用宫内胚胎电转染技术敲低胚胎发育时期中GNG3水平,利用免疫荧光染色法观察敲低GNG3后对小鼠胚胎发育阶段神经祖细胞增殖、神经元迁移、神经元迁移依赖的骨架系统及神经元凋亡的影响。研究结果:(1)从E13.5到E17.5小鼠胚胎中的GNG3蛋白表达量逐渐升高,E15.5和E17.5时在皮层中间层有大量表达。(2)在胚胎发育时期敲低GNG3影响神经元在中间层由多极向双极转化的过程,导致神经元无法正常迁移而滞留在中间层;但不影响神经前体细胞的增殖、放射状胶质细胞骨架以及神经元凋亡。第四部分:Gng3 c.14del C,c.18C>G,c.21T>G cas9-ki基因突变selleck合成小鼠表型研究研究目的:利用CRISPR-cas9技术构建Gng3 c.14del C,c.18C>G,c.21T>G cas9-ki“人源化”点突变小鼠,模拟在人类患者中发现的突变情况,分析该突变对小鼠神经发育的影响。研究内容和方法:(1)对点突变小鼠进行核磁扫描、头围测量探究该突变是否影响小鼠头围大小。(2)利用免疫荧光染色法分析点突变小鼠皮层各神经元定位情况。(3)经腹腔反复注射低剂量戊四唑(Pentetrazol,PTZ)进行癫痫诱导实验,评估点突变小鼠的癫痫易感性。(4)利用行为学平台(包括新物体识别、Y迷宫、旷场实验、高架十字迷宫)对成年点突变小鼠进行行为学检测。(5)利用免疫荧光染色法分析点突变小鼠海马组织中神经元和星形胶质细胞表达情况,利用Western blot法检测小鼠海马组织中凋亡、自噬及突触功能相关蛋白表达水平。研究结果:(1)Gng3 c.14del C,c.18C>G,c.21T>G cas9-ki点突变小鼠无头围减小、皮层厚度异常等表型。(2)点突变小鼠大脑皮层第V层SOX5阳性神经元数量明显增多,存在各层神经元定位异常。(3)点突变小鼠癫痫易感性升高,全面强直阵挛性癫痫发作时注射的PTZ剂量、发作时间以及从最小程度癫痫发作到全面强直阵挛性癫痫发作的间隔时间均显著低于野生型小鼠。(4)点突变小鼠存在空间记忆障碍,但无运动能力异常和焦虑情绪。(5)点突变小鼠胼胝体及海马区域中星形胶质细胞数目及荧光强度显著增强,但海马组织中自噬相关蛋白Beclin-1、凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3,以及突触后致密蛋白PSD95、突触小泡蛋白Synaptophysin的表达量均无异常。研究结论:(1)在原发性遗传性小头畸形家系的2名患者中发现了GNG3 c.14del C纯合缺失突变,与小头畸形致病相关。(2)GNG3 c.14del C突变为功能缺失突变,GNG3功能缺失能够影响神经细胞系增殖、迁移水平和GABAb型受体介导的信号传导过程。(3)GNG3蛋白在神经发育过程中发挥重要作用,在胚胎发育时期敲低GNG3能够影响神经元在中间层由多极向双极转化的过程,进而影响神经元迁移过程。(4)Gng3 c.14del C,c.18C>G,c.21T>G cas9-ki“人源化”点突变小鼠GNG3蛋白表达缺失,导致小鼠产生皮层神经元定位异常、癫痫易感以及空间记忆障碍等神经系统发育障碍疾病。