背景:缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic-ischaemic brain damage,HIBD)是一种由各种因素引起的脑组织氧合/灌注不足所致的非进行性脑损伤,往往会遗留下脑瘫、癫痫、智力低下等各种神经系统的后遗症,对患儿自身的生长发育、社会活动以及对其他家庭成员的影响都很大。目前临床上针对HIBD的治疗方法主要是亚低温疗法及对症支持治疗,但其临床治疗效果有限。近年来,许多人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)治疗HIBD的基础和临床研究证实了干细胞疗法的有效性和安全性,为临床治疗HIBD提供了新的方法和思路,为了进一步研究hUC-MSCs不同干预方式对幼鼠HIBD的疗效差异,我们开展了此项研究。目的:探讨通过三种不同途径(尾静脉、鼻腔及侧脑室)干预hUC-MSCs对幼鼠缺氧缺血性脑损伤的治疗效果的差异,为临床使用hUC-MSCs治疗儿童缺氧缺血性脑损伤的干预路径提供依据。方法:1.构建HIBD幼鼠模型:选择无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级健康的7日龄(postnatal day 7,PN7)新生SD(Sprague-Dawley)大鼠,雌雄不限,采用改良的RICE法构建HIBD幼鼠模型,在造模后第7天(PN14)进行hUC-MS Cs干预,干预细胞数量为0.5×106/只大鼠。2.HIBD幼鼠模型分组:随机将65只HIBD幼鼠分为HIBD组(n=17)、HIB D+Ⅳ组(n=16)、HIBD+IN 组(n=16)和HIBD+IC 组(n=16)。3.干预方法:(1)假手术组(sham):分离右侧颈总动脉,不结扎、不离断,2小时后置于常氧环境中;(2)HIBD组:分离右侧颈总动脉,远、近心端双侧结扎并于中间离断,2小时后置于8%O2+92%N2的混合气体中2小时;(3)HIBD+Ⅳ组:造模后第7天通过尾静脉干预hUC-MSCs(在0.5ml的PBS溶液里);(4)H IBD+IN组:造模后第7天通过鼻腔干预hUC-MSCs(在12ul的PBS溶液里);(5)HIBD+IC组:造模后第7天通过侧脑室干预hUC-MSCs(在5ul的PBS溶液里)。4.各组幼鼠神经行为学功能评估:在PN7、PN14及PN21动态监测各组大鼠体重情况;在PN14及PN21采用悬丝试验和竖杆试验评价各组大鼠的神经行为学功能;于PN21开始进行Morris水迷宫(Morris wateIACS-010759作用r maze,MWM)实验评价大鼠学习记忆功能。5.各组幼鼠病理学评估:行为学评估后取各组幼鼠脑组织进行切片,并通过HE染色观察各组脑组织的形态学变化,通过检测海马回(hippocampus)的CA1与CA3区、齿状回(dentategyrus,DG)区及皮层区胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillar acidic protein,GFAP)的表达水平来比较各组反应性星形胶质细胞的增殖情况,通过原位末端转移酶标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dU TP-biotin nick end lathe oncology genome atlas projectbeling,TUNEL)染色比较皮层和海马各区神经细胞的凋亡数量。结果:1.各组幼鼠经hUC-MSCs干预后神经行为学功能评估:(1)HIBD+Ⅳ组、HIBD+IN组、HIBD+IC组较HIBD损伤组,悬丝实验的掉落时间及竖杆实验的掉落角度均有所延长(P<0.0001),在Morris水迷宫实验中HIBD+IN组和HIBD+IC组较HIBD损伤组逃避潜伏期有所缩短(P<0.05),水迷宫实验第6天三个干细胞干预组较HIBD损伤组在目标象限游泳时间延长(P<0.05),提示经hUC-MSCs干预能改善HIBD幼鼠运动平衡和学习记忆能力;(2)HIBD+Ⅳ组、HIBD+IN组、HIBD+IC组之间比较,在悬丝试验中,HIB D+IC组较HIBD+Ⅳ组掉落时间明显延长(P<0.05),提示HIBD+IC组较HIBD+I V组对HIBD幼鼠运动功能的改善更明显,但HIBD+IN组与HIBD+IC组之间差异则无统计学意义(P>0.05);在竖杆试验中,HIBD+Ⅳ组、HIBD+IN组、HIBD+I C组之间的掉落角度差异无统计学意义(P>0.05),提示三个干预组对HIBD幼鼠平衡运动功能改善情况无明显差异;在Morris水迷宫中,HIBD+Ⅳ组、HIBD+IN组、HIBD+IC组之间的逃避潜伏期及在目标象限游泳时间差异无统计学意义(P>0.05),提示三个干预组对HIBD幼鼠学习记忆功能改善情况无明显差异。2.各组幼鼠经hUC-MSCs干预后病理学评估:(1)HIBD+Ⅳ组、Hselleck MK-4827IBD+IN组、HIBD+IC组较HIBD损伤组,大脑皮层和海马各区的液化、坏死程度均有所减轻,GFAP表达量及GFAP阳性细胞数量明显减少(P<0.05),神经细胞凋亡率明显降低(P<0.0001)。(2)HIBD+Ⅳ组、HIBD+IN组、HIBD+IC组之间比较,HIBD+IN组较HIBD+Ⅳ组在海马DG区的GFAP表达量减少更明显(P<0.05),HIBD+IN组和HIBD+I C组较HIBD+Ⅳ组对海马区神经细胞凋亡率降低更明显(P<0.001),HIBD+IC组比HIBD+Ⅳ组对皮层神经细胞凋亡率降低更明显(P<0.01),而HIBD+IN组与HIBD+IC组之间凋亡率对比则无明显统计学差异(P>0.05)。结论:1.hUC-MSCs三种不同途径(尾静脉、鼻腔及侧脑室)干预均能明显改善缺氧缺血性脑损伤幼鼠的神经运动功能。2.hUC-MSCs三种不同途径干预均能减轻缺血性脑损伤幼鼠脑组织损伤,减少脑组织星形胶质细胞增殖,降低脑组织神经细胞凋亡率。3.比较hUC-MSCs三种不同干预途径,经侧脑室干预途径及经鼻腔干预途径治疗效果均优于经静脉干预途径,而经侧脑室干预途径与经鼻腔干预途径的治疗效果之间则无明显差异。