研究背景:组织激肽释放酶7(kallikrein 7,KLK7)是组织激肽释放酶(kallikrein-related peptidases,KLKs)家族成员之一,为胞外分泌型蛋白质。众多研究表明KLK7的高表达在胰腺癌细胞的增殖、转移、侵袭等多种恶性生物学行中发挥至关重要的作用。前期研究以特异性靶向KLK7的自杀性底物抑制剂Compound 42为中心,揭示了KLK7功能异常可显著抑制胰腺癌细胞增殖并诱导其铁死亡。然而KLK7基因在胰腺癌细胞中的功能仍有待研究。目的:探讨BMS-907351分子量不同程度抑制KLK7表达对胰腺癌细胞增殖及死亡方式的影响,明确KLK7基因与胰腺癌细胞铁死亡的相关性。探究抑制KLK7表达对胰腺癌细胞周期的影响,揭示Compound 42抑制胰腺癌细胞周期进程的机制;为寻找胰腺癌治疗靶点提供新的理论支撑。方法:(1)通过si RNA瞬转技术、sh RNA慢病毒转染构建PANC-1 KLK7敲低细胞株(knock down,KD)及CRISPR-CAS9构建PANC-1 KLK7敲除细胞株(knock out,KO)等方式不同程度抑制胰腺癌细胞KLK7基因表达,并通过q RT-PCR对各细胞进行KLK7 m RNA水平检测。(2)通过细胞实时检测仪(real time cell analysis,RTCA)对不同程度抑制了KLK7表达的胰腺癌细胞的增殖情况进行实时动态跟踪评估其增殖能力。(3)通过western blot检测各组细胞增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、核糖核苷酸还原酶亚基M2(ribonucleoside-diphosphate reductase submit M2,RRM2)、硫氧还蛋白还原酶1(recombinant thioredoxin reductase 1,TXNRD1)、硫氧还蛋白(thioredoxin,TXN)等蛋白水平。(4)采用流式细胞术评估抑制KLK7表达后对胰腺癌细胞凋亡、坏死、胞内脂质过氧化水平及细胞周Aggregated media期的影响。(5)酶标仪检测各组细胞胞内游离铁离子水平。(6)彗星电泳实验评估KLK7小分子抑制剂Compound 42作用于胰腺癌细胞后其DNA受损情况。结果:1.si RNA瞬时转染的胰腺癌细胞KLK7抑制组、PANC-1 KD细胞株及PANC-1 KO的KLK7 m RNA水平较野生型组(wild type,WT)及相应的阴性对照组显著降低。2.不同程度抑制胰腺癌细胞KLK7表达细胞增殖能力显著受抑。RTCA结果显示较对照组相比,各KLK7抑制组72小时内增殖能力明显下降。同时si RNA处理后KLK7抑制组PCNA蛋白水平也呈下降趋势。3.si RNA抑制胰腺癌细胞KLK7表达诱导胰腺癌细胞铁死亡。流式细胞术结果显示:与对照组相比,si RNA处理后的KLK7抑制组凋亡、坏死细胞未出现显著增多;而其脂质活性氧(Lipid-reactive oxygen species,Li-ROS)水平较对照组出现显著堆积。同时KLK7抑制组GPX4蛋白水平显著降低,胞内铁离子水平明显蓄积。4.稳定抑制胰腺癌细胞KLK7表达不引起胰腺癌细胞发生铁死亡。与对照组相比,虽然各KLK7抑制组胞内铁离子水平呈上升趋势,但Li-ROS及较晚代数的PANC-1 KD株、KO株胞内GPX4蛋白水平均未表现出显著差异。5.si RNA抑制KLK7表达并不影响胰腺癌细胞的细胞周期。流式细胞术结果显示si RNA处理后KLK7抑制组与对照组细胞的细胞周期未出现显著差异。6.KLK7小分子抑制剂Compound 42通过诱导胰腺癌细胞DNA损伤,降低细胞DNA修复能力引起胰腺癌细胞的细胞周期阻滞。组学分析及western blot提示Compound 42处理组与对照组相比RRM2蛋白水平出现显著下调。同时彗星电泳实验进一步证实了Compound 42处理组细胞出现DNA重度损伤。进一步western blot检测发现硫氧还蛋白系统中的TXN及TXNRD1蛋白水平均出GSK J4 MW现代偿性上调。而这些结果在si RNA处理组中并未显现。结论:1.抑制胰腺癌细胞KLK7表达显著抑制胰腺癌细胞增殖能力。2.瞬转抑制胰腺癌细胞KLK7表达诱导胰腺癌细胞铁死亡,而敲低及敲除KLK7表达不引起胰腺癌细胞铁死亡。3.si RNA抑制胰腺癌细胞KLK7表达并不影响胰腺癌细胞的细胞周期。4.Compound 42通过诱导胰腺癌细胞DNA损伤及其修复能力下降引起胰腺癌细胞的细胞周期阻滞。