【目的】脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是一种严重且致残的疾病,会严重降低患者的生活质量并增加患者生活与经济上的负担。SCI会发生神经传递的不可逆转的中断,目前没有有效的疗法可实现神经或功能的完全恢复。竞争性内源RNA(ceRNA)网络在SCI发展和修复中起重要调节作用。本实验拟通过高通量测序筛选在SCI中差异表达的lncRNA和miRNA及其靶基因,检测ceRNA网络(lncRNA/miRNA/mRNA轴)在SCI中的作用及机制,为后续寻找SCI的治疗靶点提供实验依据。【方法】1.建立SCI模型,通过斜板实验、BBB评分、足迹检测、脊髓大体形态和Nissl染色检测大鼠模型成功。2.在脊髓损伤后1 d,3 d,7 d取出损伤中心的脊髓进行高通infant microbiome量测序(HTS),并进一步筛选出与SCI修复进程相关的miRNA—miR-6315。3.利用富集分析工具DAVID分析差异mRNA参与的基因本体论(Gene ontology,GO)系统和KEGG pathway。使用Ensembl数据库和MiRanda软件预测出Smo具有miR-6315的结合位点。4.通过qRT-PCR检测在SCI和Glu损伤后,miR-6315和Smo的表达是否与测序结果一致,双荧光素酶报告基因实验验证miR-6315对靶基因Smo的3’UTR的作用靶点。5.qRT-PCR和Western blot实验检测在大鼠SCI后1 d,7 d,14 d,28 d,miR-6315和Smo的表达水平并做相关性分析。6.通过GENEMANIA数据库预测Smo靶标可能是抗铁死亡通路因子xCT(SLC7A11)。采用qRT-PCR和Western blot检测抗铁死亡通路因子xCT,GSH,GPX4在SCI后不同时间点的表达水平。7.构建miR-6315低表达腺病毒,感染原代脊髓神经元和脊髓组织。miR-6315相对表达量采用qRT-PCR检测。脊髓神经元和脊髓组织中的分组分别为:Normal组、Glu组、Glu+NC组与Glu+miR-6315-si组;Sham组、SCI组、SCI+NC组、SCI+miR-6315-si组。通过免疫荧光染色(IF)检测神经元标记物(NeuN)、轴突再生标记物(GAP43)和突触素(SYP),划痕实验检测神经元的迁移率。BBB评分、斜板实验及电生理检测大鼠的运动功能。qRT-PCR和Western blot检测miR-6315,Smo及抗铁死亡通路因子xCT,GSH,GPX4的表达水平。8.构建Smo过表达和低表达腺病毒,感染原代脊髓神经元和脊髓组织。Smo相对表达量采用qRT-PCR和Western blot检测。脊髓神经元和脊髓组织中的分组分别为:Normal组、Glu组、Glu+Smo-NC组、Glu+Smo组、Glu+Smo-si-NC组和Glu+Smo-si组;Sham组、SCI组、SCI+Smo-NC组、SCI+Smo组、SCI+Smo-si-NC组和SCI+Smo-si组。通过免疫荧光染色(IF)检测神经元标记物(NeuN)、轴突再生标记物(GAP43)和突触素(SYP)。BBB评分、斜板实验及电生理检测大鼠的运动功能。qRT-PCR和Western blot检测Smo及抗铁死亡通路因子xCT,GSH,GPX4的表达水平。9.根据HTS数据,利用MiRanda软件对差异表达的lncRNA与显著上调的miR-6315进行结合位点预测,对Target Scan和MiRanda评分进行综合分析后,lncRNA-Lepr被选为潜在的关键lncRNA。通过双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA-Lepr和miR-6315的靶向结合关系。qRT-PCR实验检测在大鼠SCI后1d,7d,14d,28d,lncRNA-Lepr的表达水平并与miR-6315做相关性分析。10.构建lncRNA过表达腺病毒,感染原代脊髓神经元和脊髓组织。lncRNA相对表达量采用qRT-PCR检测。脊髓神经元和脊髓组织中的分组分别为:Normal组、Glu组、Glu+NC组与Glu+lncRNA-Lepr组;Sham组、SCI组、SCI+NC组、SCI+lncRNA-Lepr组。通过免疫荧光染色(IF)检测各组神经元标记物(NeuN)、轴突再生标记物(GAP43)和突触素(SYP),划痕实验检测神经元的迁移率,CCK8检测细胞活力,BDA顺行追踪检测轴突再生,ROS、Fe~(2+)和MDA的相对表达量检测铁死亡。BBB评分、斜板实验及电生理检测大鼠的运动功能。qRT-PCR和Western blot检测lncRNA-Lepr,miR-6315,Smo及抗铁死亡通路因子xCT,GSH,GPX4,铁死亡相关因子ACSL4的表达水平。【结果】1.成功建立大鼠SCI模型,大鼠后肢完全没有运动功能,脊髓损伤局部神经元减少。2.SCI 24 h的脊髓中有5个差异表达上调的miRNAs,其中miR-6315是在SCI后24 h达到最高水平,在3 d,7 d逐渐下降的差异表达最显著的miRNA。差异表达的mRNA中富集到了轴突生长锥通路,其中轴突生长锥通路因子Smo与miR-6315有结合位点。3.双荧光素酶报告基因实验证实了Smselleck抑制剂o是miR-6315的直接靶点。SCI后1d,7 d,14 d,28 d,miR-6315与Smo的mRNA的表达量呈负相关性。4.GENEMANIA数据库预测Smo可能调节抗铁死亡通路因子xCT,xCT和GPX4在损伤后1 d的mRNA和蛋白质表达最低,从损伤后7 d开始不断增加,并在第28 d达到高峰。GSH的表达变化与xCT和GPX4的变化趋势相同。xCT/GSH/GPX4轴参与SCI进展过程。5selleck激酶抑制剂.miR-6315低表达腺病毒成功感染原代脊髓神经元和脊髓组织。在损伤后的神经元及SCI 1 d,14 d,28 d的脊髓组织中,miR-6315的表达被沉默后促进神经元轴突再生、存活、突触素生成和神经元迁移,并改善大鼠远期(28d)的运动功能。沉默miR-6315后,Smo的mRNA和蛋白质表达水平显著增高,抗铁死亡通路因子xCT,GSH和GPX4的mRNA和蛋白质表达也显著升高。6.Smo低表达和过表达腺病毒成功感染原代脊髓神经元和脊髓组织。在损伤后的神经元及SCI 1 d,14 d,28 d的脊髓组织中,Smo过表达后促进神经元轴突再生、存活和突触素生成,并改善大鼠远期(28 d)的运动功能。而Smo低表达后会导致神经元数量减少、细胞胞体萎缩、神经轴突长度缩短和突触素生成减少,加重SCI诱导的运动功能障碍。Smo过表达后,Smo的mRNA和蛋白质表达水平显著增高,抗铁死亡通路因子xCT,GSH和GPX4也显著升高,Smo低表达的结果与之相反。7.通过数据库结合位点预测发现lncRNA-Lepr是在靶向miR-6315的所有差异表达的lncRNA中具有最高的结合率。双荧光素酶报告基因检测结果显示lncRNA-Lepr可以与miR-6315直接结合。对lncRNA-Lepr和miR-6315在SCI 1d、7 d、14 d、28 d的脊髓组织中的表达量进行相关性分析,结果显示两者呈负相关。8.lncRNA-Lepr过表达腺病毒成功感染原代脊髓神经元和脊髓组织。在损伤后的神经元及SCI 1 d,14 d,28 d的脊髓组织中,lncRNA-Lepr过表达后促进神经元轴突再生、存活和突触素生成,抑制Fe~(2+)、ROS和MDA的生成,并改善大鼠远期(28 d)的运动功能。lncRNA-Lepr过表达后,miR-6315的mRNA表达显著下降,Smo的mRNA和蛋白质表达水平显著增高,抗铁死亡通路因子xCT,GSH和GPX4也显著升高,铁死亡相关因子ACSL4显著下降。【结论】1.在SCI后,miR-6315与Smo存在直接结合,miR-6315低表达后,可以增加Smo的水平,上调xCT,GSH和GPX4的表达,促进神经元存活及轴突再生,并改善大鼠下肢运动功能。2.在SCI后,Smo过表达可以上调xCT,GSH和GPX4的表达,促进神经元存活及轴突再生,并改善大鼠下肢运动功能,Smo低表达则相反。3.lncRNA-Lepr与miR-6315存在竞争性抑制关系,过表达lncRNA-Lepr可通过抑制miR-6315水平,从而释放Smo,Smo表达上调后激活xCT/GSH/GPX4轴,抑制细胞铁死亡,促进轴突再生,从而改善大鼠下肢运动功能障碍。总之,本研究在SCI中鉴定了lncRNA-Lepr/miR-6315/Smo新网络。因此,lncRNA-Lepr/miR-6315/Smo轴可能是SCI治疗具有重要临床意义的候选靶点。