【目的】高微卫星不稳定性结直肠癌(high microsatellite instability colorectal cancer,MSI-H CRC)约占CRC的15%,M1型巨噬细胞为其肿瘤微环境的核心成分,发挥重要作用。本研究旨在评价M1型巨噬细胞在MSI-H CRC中的浸润及肿瘤坏死因子受体超家族成员9(tumer necrosis factor receptor superfamily member 9,TNFRSF9)在MSI-H CRC中的表达情况,体外实验探讨M1型巨噬细胞对MSI-H CRC细胞生物学功能的影响及其可能的分子机制。【方法】1、免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)分析比较58名CRC患者(MSS型30例、MSI-H型28例)癌组织中TNFRSF9的表达、M1型巨噬细胞的浸润情况。2、RT-qPCR检测TNFRSF9在CRC细胞株中的表达情况,筛选出TNFRSF9高表达的MSI-H细胞株。3、利用PMA、LPS、IFN-γ刺激THP-1极化为M0、M1型巨噬细胞,通过Western blot、RT-qPCR验证M1型巨噬细胞标志物表达,提取M0、M1型巨噬细胞上清液作为条件培养基(conditioned medium,CM),分别培养MSI-H CRC细胞,利用MTT、平板克隆、划痕、Transwell实验检测M1型巨噬细胞对MSI-H CRC细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。4、TNFRSF9 SiRNA及Si-NC瞬时转染DLD-1及HCT-15,Western blot评价转染效率,采用MTT、平板克隆实验检测TNFRSF9对MSI-H CRC细胞增殖、克隆形成能力的影响。5、ELISA实验检测M0 CM、M1 CM中肿瘤坏死因子配体超家族成员9(tumor necrosis factor ligland superfamily member 9,TNFSF9)的差异,M1 CM分别培养Si-TNFRSF9与Si-NC组DLD-1、HCT-15细胞,通过MTT、平板克隆、划痕、Transwell侵袭实验进一步验证M1型巨噬细胞通过TNFSF9/TNFRSF9通路发挥作用。6、Western blot验证M0 CM、M1 CM培养DLD-1和HCT-15细胞后PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响,M1 CM分别培养Si-TNFRSF9与SiNC组DLD-1和HCT-15细胞后PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响。【结果】1、与MSS CRC相比,TNFRSF9在MSI-H CRC组织中高表达(P<0.01),M1型巨噬细胞在MSI-H CRC中浸润程度更高(P<0.01)。2、RT-qPCR结果显示TNFRSF9在DLD-1、HCT-15中相对高表达(P<0.0001),选取这两株进行后续实验。3、RT-qPCR、Western blot实验验证M1型巨噬细胞标志物表达明显升高,M1型巨Telemedicine education噬细胞诱导成功。MTT实验结果表明,与第0天相比,M1 CM组DLD-1和HCT-15的增殖速度在第1、3、5天与M0 CM组相比降低;平板克隆形成实验结果显示,与M0 CM组相比,M1 CM组细胞的克隆形成能力减弱;划痕实验结果显示,M1 CM组的细胞愈合率较M0 CM组明显减弱;Transwell侵袭实验结果显示,M1 CM组侵袭力明显减弱。4、WB结果显示,转染TNFRSF9 SiRNA的DLD-1和HCT-15细胞中TNFRSF9的表达显著下调。MTT结果显示,Si-TNFRSF9组DLD-1细胞和HCT-15细胞的增殖速度较Si-NC组无明显差异;克隆形成实验显示,SiTNFRSF9组DLD-1和HCT-15细胞的克隆形成能力较Si-NC组无明显差异。5、ELISA实验显示,M1 CM中TNFSF9含量较M0 CM中明显升高,M1CM分别培养TNFRSF9 SiRNA和Si-NC转染的DLD-1、HCT-15细胞,MTT实验结果表明,与M1 CM+Si-NC组相比M1 CM+Si-TNFRSF9组细胞增殖速度增快;克隆实验显示,M1 CM+Si-TNFRSF9组细胞克隆形成数明显增加;划痕实验结果表明,M1 CM+Si-TNFRSF9组细胞迁移能力增加;Transwell侵袭实验显示,M1 CM+Si-TNFRSF9组细胞侵袭能力增加。6、WB结果显示,与PI3K/Akt/mTOR抑制剂M0 CM组相比,M1 CM组DLD-1和HCT-15细胞中p-PI3K、p-AKT蛋白的相对表达selleck抑制剂量降低(P均<0.05),而PI3K和AKT蛋白的相对表达量无明显差异(P均>0.05),M1 CM分别培养TNFRSF9 SiRNA和Si-NC转染的DLD-1、HCT-15细胞,与M1 CM+Si-NC组相比,M1 CM+SiTNFRSF9组DLD-1和HCT-15细胞中p-PI3K、p-AKT蛋白的相对表达量增加(P均<0.05),而PI3K和AKT蛋白的相对表达量无明显差异。【结论】1、TNFRSF9在MSI-H CRC中高表达,M1型巨噬细胞在MSI-H CRC中浸润较多,M1型巨噬细胞发挥抑癌作用;2、M1型巨噬细胞可能通过TNFSF9/TNFRSF9通路抑制MSI-H CRC细胞增殖、侵袭、迁移能力;3、M1型巨噬细胞可能通过调控PI3K/AKT信号通路影响MSI-H CRC细胞的生物学功能。