大肠杆菌、沙门氏菌等病原微生物感染常引起动物产生过度的炎症反应,造成畜禽肠道炎症疾病频发,给国内外养殖业带来了巨大的经济损失。禽类肠道炎症的发病机制及防治方法一直是众多研究的热点话题,炎症的发展过程需要多种免疫细胞的参与,其中巨噬细胞是炎症反应最主要的免疫细胞。本研究以禽巨噬细胞系(chicken macrophage cell line,HD11)为研究对象,通过转录组与代谢组学测序探寻炎症发生时基因转录和细胞代谢的动态变化,经组学联合分析定位差异基因与差异代谢物的互作网络,确定关键信号通路及其与细胞代谢的关联;在此基础上,本研究对上述关键通路进行有效阻断,探究阻断该通路对HD11细胞促炎因子及代谢过程的重要调控作用。主要研究内容如下:1.本研究应用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)构建体外炎症模型,通过CCK8法和实时荧光定量PCR检测LPS不同浓度和不同时间点对HD11细胞活力及IL-1βm RNA表达的影响。结果表明,在HD11细胞中,1μg/ml LPS刺激细胞6 h可诱导促炎因子IL-1β显著升高(P<0.05),且此过程无明显毒性作用,因此可作为构建HD11细胞炎症模型的最佳方案。2.将HD11细胞分为对照组(C组)和LPS模型组(LPS组),通过转录组测序(RNA-Seq)、超高效液相色谱-串联飞行时间质谱(UPLC-Q-TDF MS)对细胞样BI 10773采购本进行转录与代谢组学分析。(1)转录组测序结果发现,LPS组共有1319个差异基因显著上调(P<0.05),744个差异基因表达显著下调(P<0.05);KEGG通路富集显示,差异表达基因显著富集于Toll受体介导的MAPK、NF-κB信号通路。结合数据库分析共筛选到42个与MAPK信号通路相关的基因,其中FOS、JUN、MYC、NF-κB等35个基因显著上调(P<0.05),CAT等7个基因显著下调(P<0.05)。随后,使用实时荧光定量PCR对通路关键基因表达水平进行验证,结果表明,LPS组FOS、JUN、MYC等基因表达显著增加(P<0.05),进一步证实LPS激活了MAPK信号通路,并引起相关核转录因子表达增加,诱导了细胞炎症反应的发生。(2)代谢组测序发现,对照组与LPS组间共筛选到88个差异代谢物,其中谷氨酸、谷胱甘肽等显著下调(P<0.05)。KEGG富集分析结果显示,差异代谢物显著富集于三羧酸循环、谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢等过程,说明这些通路可能与炎症反应的发生有关。基因-代谢产物互作网络联合分析显示,谷氨酸、苹果酸、花生四烯酸等细胞代谢物的下调与MAPK通路中的差异表达基因c-JUN、c-FOS、NF-κB、i NOS相关,因此,推测MAPK信号通路参与炎症细胞代谢的调控。3.为了探究MAPK信号通路对炎症细胞中炎症因子表达及细胞代谢水平的调控作用,筛选MAPK信号通路抑制剂-黄芪皂苷IV(Astragaloside IV,AST IV)特异性阻断该信号通路。实验将HD11细胞分为4组:对照组(C),脂多糖炎症组(LPS组,L),抑制剂+脂多糖组(AST IV+LPS组,A+L),抑制剂组(AST IV组,A);采用实时荧光定量PCR、Western blot、ELISA,检测不同处理组HD11细胞MAPK信号通路相关因子、促炎因子的m RNA表达及蛋白水平变化;应用流式细胞术、荧光探针、试剂盒方法检测HD11细胞线粒体膜电位、ROS生成、谷胱甘肽代谢的变化情况。(1)在HD11细胞中,L组MAP3K1、MAP2K1/2/4、ERK、JNK、c-JUN、c-FOS m RNA及其磷酸化蛋白含量均显著高于C组(P<0.05);A+L组上述因子m RNA表达及磷酸化蛋白含量显著低于L组(P<0.05),表明HD11细胞发生炎症反应时,MAPK信号通路被显著激活;AST IV可抑制MAPK通路的过度活化。在HD11细胞中,L组IL-1β、TNF-α、IL-6、NF-κB、i NOS等促炎因子AM-2282表达量在m RNA与蛋白水平均显著高于C组(P<0.05);A+L组促炎因子m RNA及蛋白表达量显著低于L组(P<0.05),表明LPS诱导的HD11细胞炎症模型中,AST IV可通过抑制MAPK的过度活化,降低促炎因子表达,从而发挥抑制炎症的作用。(2)与C组相比,L组线粒体膜电位显著下降(P<0.05),ROS含量显著增多(P<0.05);与L组相比,A+L组线粒体膜电位显著升高(P<0.05),ROS产生受到明显抑制(P<0.05),提示LPS刺激使HD11细胞线粒体结构发生破坏,功能紊乱,ROS产生增加;AST IV可通过抑制MAPK的过度活化,保护线粒体形态及功能,改变细胞代谢过程,使ROS含量降低,从而干预炎症反应。(3)L组GCLM、GPX1、GPX4 m RNA表达水平显著低于C组(P<0.05);A+L组GCLM、GPX1、GPX4 m RNA表达水平显著高于L组(P<0.05)。与C组相比,L组谷氨酸、T-GSH、GSH含量显著降低(P<0.05),GSSG含量显著升高(P<0.05);与L组相比,A+L组谷氨酸、T-GSH、GSH含量显著增加(P<0.05),GSSG含量显著降低(P<0.05),表明LPS诱导的HD11细胞炎症模型中,通过阻断MAPK通路活化,可改善谷氨酸-谷胱甘肽代谢过程,使谷氨酸、还原型谷胱甘肽含量增加,发挥抗氧化防御功能,以抑制炎症反应的发生。综上所述,1μg/ml LPS诱导6h可作为构建HD11细胞炎症模型的最佳方案。LPS激活了MAPK信号通路,且MAPK信号通路的转录因子c-JUN、c-FOS可调控谷氨酸、苹果酸、花生四烯酸等代谢物含量。MAPK信号通路被有效阻断后,该通路一方面抑制转录因子c-JUN、c-FOS的活化,减少促炎因子的产生;另一方面可对免疫细胞代谢水平进行调Defensive medicine节,维持线粒体稳态,减少ROS生成,改善谷氨酸-谷胱甘肽代谢,进而参与炎症反应及细胞功能的调控,为进一步探究炎症疾病的发生机制和寻找新的靶向药物提供重要理论和实验依据。