随着社会发展和国防需要,每年因各种原因进驻高原的人群呈现递增趋势。因急性低压缺氧(AHH)导致的脑损伤也得到人们更多关注。AHH脑损伤的患者可表现为不同程度的头痛,严重者甚至发生高原脑水肿(HACE)。目前,针对AHH脑损伤的防治存在较多局限性,主要原因是其发生发展机制尚不明确。已有研究证实血-脑屏障(BBB)破坏以及脑血流增加是AHH脑损伤发生发展的主要原因,由此可见脑血管功能在其中发挥着重要作用。脑血管平滑肌作为脑血管壁的重要组成部分,在维持大脑血管正常的舒缩活动中发挥着至关重要的作用。此外,线粒体钙离子摄入蛋白1(MICU1)对线粒体钙起到重要调节作用,其可通过感受线粒体胞浆中的钙离子浓度,调控线粒体钙单向转运体(MCU)对钙离子的摄取,这在维持细胞能量代谢以及细胞其他生理过程中扮演着重要角色。同时,MICU1的表达可受缺氧调节。在既往研究中,血管平滑肌细胞(VSMCs)以及MICU1均被证实与多种缺血缺氧性疾病的发生发展有关。本课题以AHH脑损伤动物模型和细胞缺氧模型为基础,明确了血管平滑肌MICU1在AHH脑损伤中发挥的作用,并且探索了相关机制,这为AHH脑损伤的防治提供了新的理论基础。实验一、急性低压缺氧对脑组织及脑血管结构的影响目的构建AHH脑损伤动物模型,为后续AHH脑损伤的机制研究及治疗干预措施的实施提供支撑。方法采用雄性C57BL/6J小鼠,将它们随机分成5组:地面(Plain)组、急性低压缺氧1天(AHH 1 d)组、急性低压缺氧3天(AHH 3 d)组、急性低压缺氧5天(AHH 5 d)组、急性低压缺氧7天(AHH 7 d)组。将Plain组动物置于当地(西安)饲养,海拔约400 m;使用小型动物实验用环境模拟舱模拟低压缺氧环境,将AHH组小鼠放入其中,并设置模拟海拔高度为6000 m,分别连续暴露1 d,3 d,5 d以及7 d。通过HE染色、尼氏染色以及TUNEL染色比较各组动物脑损伤情况。利用免疫组化染色标记VSMCs特异性标志物α-SMA,观察脑组织中血管平滑肌的结构变化。结果HE染色表明:AHH 5 d组小鼠的脑组织间隙较Plain组明显增宽,皮层血管扩张的同时神经元大量萎缩、核深染加剧;AHH 7 d组小鼠脑细胞核深染情况较AHH 5 d组进一步加重。尼式染色结果提示:随着AHH暴露时间的增加,小鼠脑神经元损伤逐渐加重。TUNEL染色结果显示:缺氧时间的延长会导致阳性细胞数的增多,但AHH 5 d与AHH 7d组的脑细胞凋亡情况无明显差异(~(ns)P>0.05)。免疫组化染色提示:prostate biopsyAHH 5 d组小鼠大脑α-SMA表达最少(~(**)P<0.01),血管平滑肌结构损伤最严重。结论模拟海拔高度6000 m、持续暴露5 d可使小鼠发生明显的脑损伤,并且该条件下小鼠脑血管平滑肌结构明显改变。本研究从病理学的角度确定了AHH脑损伤动物模型构建的理想参数,为后续AHH脑损伤的相关研究提供了支撑。实验二、急性低压缺氧对脑血管平滑肌结构功能及MICU1表达的影响目的观察AHH脑损伤动物模型中脑血管平滑肌细胞(CVSMCs)功能结构的变化,并明确AHH暴露对小鼠CVSMCs中MICU1表达的影响。方法将雄性C57BL/6J小鼠随机分为2组:地面组(Plain)和急性低压缺氧5 d组(AHH5 d),实验条件同“实验一”描述。使用Western blotting检测两组动物大脑底部动脉(包括Willis环及其分支)α-SMA、Calponin 1以及SM22α的蛋白表达量。使用免疫荧光染色对两组小鼠大脑α-SMA以及MICU1的表达进行检测。结果Western blotting检测结果显示:AHH脑损伤时,小鼠脑血管平滑肌与收缩功能结构相关蛋白α-SMA、Calponin 1以及SM22α表达下降(~*P<0.05,~(**)P<0.01)。免疫荧光染色结果显示:与Plain组相比,急性低压缺氧脑损伤时小鼠脑血管平滑肌MICU1表达下降(~(**)P<0.01)。结论AHH脑损伤会导致小鼠脑血管平滑肌收缩功能发生改变,并且AHH暴露会减少血管平滑肌细胞MICU1的表达。实验三、MICU1对急性缺氧暴露下脑血管平滑肌细胞的作用及其相关机制目的构建原代小鼠CVSMCs的急性缺氧模型,并在此基础上探究MICU1表达改变对急性缺氧暴露下小鼠CVSMCs的影响,进一步研究其相关机制。方法分离培养原代小鼠CVSMCs,并采用转染MICU1 si RNA以及腺病毒的方式抑制或过表达细胞MICU1的表达。将处于对数生长期的细胞分为常氧组、缺氧组、缺氧-MICU1小干扰-NC组、缺氧-MICU1小干扰组、缺氧-MICU1过表达-NC组、缺氧-MICU1过表达组。所有缺氧组的细胞均被放置于缺氧培养箱中缺氧(1%O_2,5%CO_2,37℃)处理(除CCK-8实验外,其余实验均缺氧24 h),常氧组的细胞置于常氧培养箱中正常(21%O_2,5%CO_2,37℃)培养。流式细胞技术Annexin V FITC/PI双染检测各组细胞的凋亡率,CCK-8检测细胞的增殖情况。对常氧组、缺氧组、缺氧-MICU1小干扰组、缺氧-MICU1过表达组的细胞进行转录组以及蛋白质组学测序,并在此基础上进行联合分析,根据测序分析结果,使用商品化试剂盒对各组细胞丙酮酸(PA)生成量、丙酮酸脱氢酶(PDH)活性和乳selleck Empagliflozin酸(LA)含量进行检测。结果Annexin V FITC/PI双染结果显示:过表达MICU1可以减少缺氧情况下CVSMCs的凋亡(~*P<0.05);反之,干扰MICU1的表达会加重缺氧暴露下的细胞凋亡(~(**)P<0.01)。CCK-8结果显示:随着缺氧时间的延长,细胞的生长会被抑制;干扰MICU1的表达会降低细胞整个缺氧过程中的生长速率,而过表达MICU1则可提高细胞在缺氧暴露下的增殖效率。转录组及蛋白质组学联合分析结果显示:在m RNA水平和蛋白水平共发现常氧组和缺氧组的差异分子中有33个同步上调,GO以及KEGG富集分析发现这部分的差异表达基因(DEGs)主要与ATP代谢、糖酵解/糖异生相关;GSEA结果明确了急性缺氧暴露下MICU1的表达改变会对小鼠CVSMCs的ATP生成产生影响。通过商品化试剂盒检测发现:过表达MICU1可以增加急性缺氧暴露下CVSMCs的PA和LA生成量(~(**)P<0.01),同时降低PDH活性(~*P<0.05);而抑制MICU1表达则可使得CVSMCs在急性缺氧暴露下PA和LA生成量减少(~*P<0.05,~(**)P<0.01)、PDH活性升高(~(**)P<0.01)。结论MICU1可调节急性缺氧暴露下小鼠CVSMCs的增殖效率、凋亡情况以及糖酵解相关功能。实验四、血管平滑肌MICU1的表达差异对急性低压缺氧脑损伤的影响目的验证血管平滑肌MICU1表达差异对AHH脑损伤的影响。明确血管平滑肌MICU1可成为AHH脑损伤的治疗干预靶点。方法将雄性C57BL/6J小鼠随机分为5组:Plain组、AHH组、AHH-MICU1-NC组、AHH-MICU1-过表达组、AHH-MICU1-干扰组。其中干扰组、过表达组以及NC组的动物模型均由经内眦静脉注射不同腺相关病毒(AAV)构建而成。采用小动物活体成像技术、免疫荧光染色以及Western blotting实验对AAV的靶向性、特异性以及转染效率进行检测。将除Plain组以外的动物均置于模拟海MK-2206 IC50拔6000 m高度连续暴露5 d,然后分别对所有组动物进行Morris水迷宫实验以及BBB通透性检测。最后采用HE染色、尼氏染色以及TUNEL染色评估各组动物的脑损伤情况。结果小动物活体成像、免疫荧光染色以及Western blotting实验均证明,注射AAV 28d后,病毒可成功感染小鼠脑组织,并使脑血管平滑肌MICU1的表达发生明显改变(~*P<0.05)。Morris水迷宫实验结果表明:AHH-MICU1-干扰组小鼠的逃避潜伏期较NC组延长(~*P<0.05);AHH-MICU1-过表达组在检测期跨越平台次数以及原平台区域滞留时间的百分比上均比NC组小鼠表现更好(~*P<0.05)。BBB通透性检测结果显示:AHH暴露会导致小鼠BBB通透性增强(~*P<0.05);而过表达血管平滑肌MICU1可降低AHH暴露下小鼠BBB的通透性(~*P<0.05)。HE染色结果表明:血管平滑肌MICU1的过表达可使AHH暴露下的脑细胞损伤较NC组减轻;与之相反,干扰血管平滑肌MICU1的表达会加重AHH暴露导致的脑损伤。尼式染色结果表明:过表达血管平滑肌MICU1可以明显改善AHH暴露下的神经元损伤(~*P<0.05);干扰血管平滑肌MICU1则可加重AHH导致的神经元损伤(~*P<0.05)。TUNEL染色结果显示:过表达血管平滑肌MICU1可以降低AHH暴露下小鼠脑细胞凋亡相关蛋白的表达(~(**)P<0.01);反之,干扰血管平滑肌MICU1表达则使得AHH暴露下的小鼠脑细胞凋亡相关蛋白表达量增加(~*P<0.05)。结论血管平滑肌MICU1的过表达可明显改善小鼠在AHH暴露下导致的脑损伤。血管平滑肌MICU1可成为AHH脑损伤的治疗干预靶点。