研究背景铅(lead,Pb)是一种典型的环境重金属污染物,被列为ⅡB类环境致癌物名单,广泛存在于生产和生活环境当中。铅的毒性损害涉及神经、消化、造血及泌尿系统等等。肾脏是人体内铅的重要排泄器官,也是铅的毒性损害作用的主要靶器官之一,但其毒作用机制尚未完全阐明。外泌体(exosomes)是一种直径为30～120nm的纳米级脂质双分子层膜结构。人体细胞分泌的外泌体,广泛存在于血液、乳汁、尿液和脑脊液等体液当中。外泌体富含特定的生物活性分子,并具有典型的细胞异质性,在细胞间的信号传导及应对外环境的应激反应过程中具有极其重要的作用。Ykt6是一种常见的序列高度保守的SNAREs蛋白家族成员,研究发现,Ykt6是控制外泌体分泌的关键蛋白分子之一。Ykt6表达下调或缺失会抑制外泌体的分泌。双荧光素酶报告基因分析显示,miR-584-5p能靶向调控Ykt6的表达。但在Pb的环境胁迫下,miR-584-5p/Ykt6通路的作用及其机制尚不清楚。本论文研究Pb暴露对肾小管上皮细胞(HK-2)miR-584-5p/Ykt6信号通路及外泌体分泌的影响,并研究该途径在Pb暴露对HK-2细胞的毒性效应中的作用及机制。研究目的本论文旨在探索miR-584-5p/Ykt6通路介导的外泌体分泌在Pb致HK-2细胞毒性效应中的作用及分子机制,为Pb的毒性作用的预防和控制工作实践提供技术支撑。研究方法1.首先通过CCK-8法测定醋酸铅(Pb(Ac)2)及外泌体CHIR-99021分子量抑制剂GW4869对HK-2细胞的毒性并计算IC50,以确定后续实验的染毒剂量;细胞形态学、彗星实验、微核实验、流式细胞术等检测细胞遗传毒性及细胞凋亡情况;2.利用超速离心法提取细胞外泌体,透射电镜(TEMSaliva biomarker)对外泌体进行形态学表征,BCA法对外泌体进行定量分析;3.提取不同处理组细胞RNA及蛋白,qRT-PCR和Western blot分析不同处理组细胞miR-584-5p及Ykt6表达水平;4.最后,转染miR-584-5pmimic建立其高表达水平的HBucladesine NMRK-2细胞,检测Ykt6表达水平及外泌体分泌量的变化,并分析miR-584-5p高表达后Pb(Ac)2对HK-2细胞毒性效应的影响。研究结果1.Pb(Ac)2处理 72h 之后,与 HK-2 组相比,20μM Pb(Ac)2组细胞OTM、MN(%)、细胞凋亡率(%)增加;GW4869组,抑制外泌体分泌之后,细胞OTM、MN(%)以及细胞凋亡率(%)进一步增加。2.超速离心法成功分离出HK-2细胞外泌体,BCA法测定外泌体分泌量,结果表明,与HK-2组相比,GW4869组外泌体分泌量降低;20 μM Pb(Ac)2组外泌体分泌量增加。3.qRT-CR 和 Western blot 分析发现 20μM Pb(Ac)2 组细胞 miR-584-5p 表达水平降低;Ykt6mRNA和蛋白的表达水平升高。4.转染miR-584-5pmimic,建立miR-584-5p高表达的HK-2细胞模型,Ykt6表达水平降低,外泌体分泌量减少。5.转染 miR-584-5p mimic,建立miR-584-5p 高表达的 HK-2 细胞模型,细胞 OTM、MN(%)以及细胞凋亡率(%)增加。研究结论1.Pb(Ac)2暴露诱导HK-2细胞明显的DNA损伤、染色体损伤以及细胞凋亡。2.Pb(Ac)2暴露激活miR-584-5p/Ykt6信号通路,介导外泌体分泌增强。3.miR-584-5p/Ykt6信号通路介导的外泌体分泌参与了 Pb(Ac)2对HK-2细胞的毒性效应。