核孔复合体(Nuclear pore complex,NPC)介导的核质转运(Nucleocytoplasmic transport,NCT)功能是保障RNA及蛋白质进出细胞核的基础。核质转运功能异常是许多神经退行性疾病共同的病理生物学基础。细胞中不溶性的聚集体能够使核孔蛋白错误聚集,进而引起核质转运障碍,导致相关疾病的发生。青光眼是以视神经进行性变性为特点的神经退行性疾病,临床表现为视网膜神经节细胞进行性、不可逆性丢失、视网膜神经纤维层缺损,并伴有相应视野损害。OPTN基因位于10号染色体短臂上,由其编码的OPTN蛋白由577个氨基酸组成,其结构包括LC3结合域、泛素结合域、锌指结构、亮氨酸拉链结构域等。这些结构域赋予OPTN蛋白多种细胞功能。其中包括:参与自噬、协助囊泡运输、维持高尔基体形态、调控NF-κB通路Apoptosis抑制剂等。它能够通过泛素结合域来结合泛素,并通过其LC3结构域结合自噬体相关蛋白LC3。近些年来,视神经病变诱导基因OPTN的E50K基因突变(OPTN-E50K)成为正常眼压性青光眼研究领域中的热点。然而,迄今为止,OPTNE50K形成的颗粒状聚集体是否会对细胞核的结构和功能产生影响尚未见文献报道。另外OPTN-E50K导致神经节细胞丢失的分子生物学机制尚不完全清楚。蛋白-蛋白间相互作用是细胞生命活动的基础,也是生命科学,特别是医学研究领域核心问题之一。邻近依赖生物素标记(Proximity-dependent biotin identification,Bio Lysates And ExtractsID)技术被广泛应用于蛋白质间相互作用的研究,成为识别蛋白间相互作用的重要工具。其基本原理是将生物素连接酶与感兴趣的蛋白质/靶蛋白(Protein of interest,POI)融合,当在细胞中共表达生物素连接酶-POI融合蛋白时,可以诱导与POI瞬时或持续相互作用的蛋白质和邻近的蛋白质被生物素标记,此过程称为生物素化。随后用链霉亲和素琼脂糖珠富集、纯化这些生物素化的蛋白,再通过质谱鉴定这些被富集、纯化的diABZI STING agonist使用方法蛋白,从中发现并筛选出关键蛋白及相关通路,并在后续实验中对其功能进行表征,进而发掘出其中关键分子及作用机制。基于此,我们应用Bio ID技术,结合质谱鉴定分析,对与OPTN相互作用的蛋白进行富集、纯化和鉴定分析,构建出了完整的OPTN-蛋白相互作用网络。在此基础上发现并筛选其中的关键蛋白。随后,我们采用生物信息学技术,结合细胞生物学和分子生物学技术,对这些关键蛋白的功能进行了表征,发现OPTN-E50K聚集体能够富集核孔复合体和核质运输关键蛋白,导致细胞核结构发生改变和核质运输功能异常,推测这可能是引起视神经退行性病变可能的的分子病理学基础,为探讨青光眼发生的病理生物学机制提供了新的思路,具有重要的科学意义和医学价值。具体研究内容及取得的成果总结如下:1.设计并构建出myc-Bio ID-OPTN质粒。利用分子克隆技术,将生物素连接酶(Bir A*)基因与OPTN基因融合,在Neuro-2A神经母细胞瘤细胞中共同过表达myc-Bio ID标记的OPTN-WT或其E50K突变体。实验结果表明,OPTN与Bio ID融合不会影响OPTN在细胞中的正确定位。2.利用免疫印迹技术,对链霉素亲和素琼脂糖珠纯化结合的生物素化蛋白进行检测。与对照组相比,实验组表现出了显著的生物素化模式,即生物素化蛋白在转染myc-Bio ID-OPTN的细胞中得到了富集。通过链霉亲和素亲和层析纯化了这些生物素化蛋白,并采用质谱技术对其进行了鉴定,结合生物信息学技术,建立了完整的OPTN-WT及OPTN-E50K的蛋白-蛋白相互作用图谱。生物信息学分析结果显示,OPTN-E50K聚集体富集核孔复合体和核质运输蛋白的组分。3.利用细胞免疫荧光染色,结合荧光显微镜技术,对蛋白质组学的结果进行表征。同时,为了检验OPTN与NPC及其组分核孔蛋白(Nucleoporins,Nups)的相互作用,我们对OPTN-WT或OPTNE50K与EGFP-Nups进行共转染。结果发现,OPTN-E50K引起核孔蛋白Nup50、Nup62、Nup98、Nup214,Ranbp2的形态及位置发生改变,而以上核孔蛋白均属于含有苯丙氨酸-甘氨酸重复序列(Phenylalanine-Glycine repeat,FG)结构域,因此我们对内源性FGNups进行染色。结果发现OPTN-E50K与内源性的NPC中的FGNups存在相互作用,能够使其从NPC中解聚,进入细胞质,产生异常聚集。随后,为探究OPTN-E50K对跨膜核孔蛋白的作用,我们将OPTN与跨膜核孔蛋白POM121共转染后发现,受m Cherry-OPTNE50K的影响,跨膜核孔蛋白POM121的位置也被破坏。接下来,我们利用抗层粘连蛋白B的抗体,对核纤层的完整性进行检测,发现核膜发生内陷和折叠,表明EGFP-OPTN-E50K在细胞质内发生错误定位,导致了细胞核形态发生变化。4.为进一步探究OPTN对细胞核功能的影响,我们利用免疫荧光染色、荧光原位杂交技术对核质转运功能进行评估。为了检查核蛋白入核功能是否受到E50K基因突变的影响,我们在N2a细胞中将EGFP、EGFP-OPTN或EGFP-OPTN-E50K与核转运荧光报告蛋白NES-td Tomato-NLS共表达,结果发现过表达OPTN-E50K会导致荧光报告蛋白在细胞质中积累,提示OPTN入核功能受损。为了研究OPTN是否影响m RNA的运输,我们通过利用荧光原位杂交技术对m RNA的核质分布进行定量研究,结果发现OPTN在细胞质内的错误聚集会引发poly(A)RNA在细胞核内滞留,提示m RNA输出受损。5.为探究m RNA转运受损的机制,我们利用免疫荧光染色技术对参与m RNA转运的重要蛋白THOC2与GLE1进行定位研究。结果显示,OPTN-E50K会引起THOC2、GLE1发生错误聚集,从而影响其发挥正常功能,这为OPTN引起RNA输出功能受损的机制提出了一种新的可能。综上,本研究利用Bio ID技术,富集、纯化与OPTN-E50K相互作用的蛋白,并采用蛋白质组学对富集的蛋白进行了解析,探讨了OPTN-E50K聚集体的组成及其功能,发现OPTN-E50K与核孔复合体间存在相互作用,引起OPTN在细胞质内聚集,干扰正常的核质转运,引起视神经病变,推测这可能是青光眼发病的重要病理生物学基础。