γ-内酯是自然界中存在的一类次生代谢产物,在化学上被归类为γ-羟基酸的环酯。它们具有一系列独特且重要的化学活性,可以广泛应用于食品风味、药物开发、生物防治和保护以及生物相容性材料等多个领域。但目前γ-内酯尤其是手性γ-内酯的合成受到诸多限制,如需要已活化的底物、底物与内酯有相当的经济价值、反应步骤繁多、需要贵金属催化剂和严苛的反应条件等。因此,利用绿色、生物可再生底物直接合成γ-内酯是一项非常有价值的工作。在有机体中,γ-内酯合成与脂肪酸代谢相关。受自然策略的启发,我们设想通过亚甲基C-H键的羟基化和内酯化直接从自然界广泛存在、绿色、生物可再生的脂肪酸中获取γ-Decitabine小鼠内酯。我们选择细胞色素P450酶家族的羟基化酶P450BSβ为研究对象。野生型P450BSβ可以借助过氧化氢旁路途径催化脂肪酸生成α-羟基脂肪酸和β-羟基脂肪酸。我们期望通过对P450Bsβ定向进化得到能以较高区域选择性和较高立体异构选择性在脂肪酸的Cγ位实施氧化的突变体,从而实现从脂肪酸到手性γ-内酯的一步合成。本研究依据P450酶羟基化反应机理和P450BSβ晶体结构,借鉴P450家族酶的定向进化经验,选取了底物及Heme结构域7 (?)范围内的38个位点进行迭代饱和突变。经过五轮迭代饱和突变,最终得到P450BSβ-G290I/L78G/F173S/Q85F这一突变体,它能以93%的Cγ区域选择性和89%底物转化率催化辛酸(C8:0)转化为γ-辛内酯,产物对映体比例(enantiomeric ratio,er)达到95:5。本突变体对5 mM辛酸最适H2O2浓度为5 mM,生成γ-内酯转换数(Turnovernummechanical infection of plantber)和转换效率(Turnoverfrequency)分别达到3278和364min-1,具有较为优良的酶活性指标LXH254分子式。此外,我们还对这一突变体催化辛酸生成γ-辛内酯进行了制备级扩大实验,产率达到70%,说明该突变体具有应用于大量合成的潜力。综上所述,该突变酶能以廉价的过氧化氢为氧化剂,在温和的反应条件下催化绿色、廉价、生物可获得的辛酸以较高区域选择性、较高立体异构选择性和较高反应活性生成手性的(S)-γ-辛内酯。本研究通过对P450BSβ的定向进化开辟了酶法催化脂肪酸一步合成手性γ-内酯的新路径,成功拓宽了 P450BSβ的应用范围,为P450酶的定向进化改造提供了理论和实践参考。