RAF信号通路

胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是一种强侵袭性恶性脑肿瘤,患者中位生存期12-15个月,常规的治疗方法是手术切除,结合放疗和替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)辅助化疗。TMZ的内在性耐药和获得性耐药是GBM治疗的主要障碍,已探明机制包括血脑屏障以对抗肿瘤靶向药物的作用,但是其耐药机制仍然不是十分清楚。多项研究显示O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(O6-methylguanine methyltransferase,MGMT)对TMZ诱发的肿瘤基因损伤能够直接修复,这是TMZ耐药的一个重要原因,但最近发现TMZ耐药的部分GBM患者表现出MGMT活性缺失。因此,迫切需要明确不依赖于MGMT的TMZ耐药机制,并制定出针对GBM患者的替代化疗策略。本研究基于CPTAC数据库筛选出在Empagliflozin溶解度胶质瘤中改变频率较高的CtIP和PAXX基因;通过CGGA数据库分析了其表达水平与患者生存及预后的相关性,结果显示低m RNA水平以及高甲基化水平有利于患者存活和预后,即抑制RBBP8和PAXX基因有利于患者存活;使用斯皮尔曼系数计算相关性、筛3-MA NMR选共表达基因,并利用KEGG(京都基因与基因组百科全书)分析富集信号通路,发现主要富集到代谢、细胞凋亡、DNA损伤修复通路,为后续通过实验阐明CtIP和PAXX基因在胶质瘤治疗中的潜在价值奠定基础。同时,我们对于TMZ以及其在人体中的活性药物MTIC进行了量子化学计算,从HOMO-LUMO(最高占据轨道与最低空轨道)、ELF(电子定域化函数)、ALIE(平均局部电离能)多个方面描述其化学性质,并基于靶点预测和分子对接对其潜在的药物功能进行挖掘,发现其可能有抑制HR修复,JNK通路,NFκB通路的潜力,有助于更深入地认识这一药物,为后续新型抗胶质瘤药物的开发提供线索。前期已发表的研究表明,DNA损伤修复是一种促成TMZ耐药的重要BIOPEP-UWM database机制,结合生物息学分析,我们认为DNA损伤修复的关键因子CtIP和PAXX可能是改善TMZ耐药GBM化疗的潜在靶点。临床TMZ的使用能够影响细胞自噬的发生,从而逃避死亡,细胞成功逃避死亡是TMZ耐药的又一影响因素。因此,影响GBM的死亡方式也是导致其对TMZ耐药的一个重要方式,进一步了解TMZ如何影响GBM死亡以及TMZ耐药后死亡方式的变化对深刻理解GBM的TMZ耐药过程和机制有重大意义。本论文首先通过药物浓度递增法构建TMZ耐药U87细胞株(U87-TR);随后,基于CtIP和PAXX在DNA修复过程中的重要作用,利用CRISPR/Cas9技术分别敲除了CtIP和PAXX;通过分析蛋白表达、细胞生长、克隆形成和裸鼠成瘤实验,探讨CtIP和PAXX在逆转TMZ耐药中的作用;并进一步研究CtIP和PAXX在TMZ耐药性中的分子机制,包括蛋白相互作用、同源重组(HR)、非同源末端连接(NHEJ)和碱基切除修复(BER)。结果显示,在U87-TR细胞中,CtIP和PAXX的蛋白表达显著高于野生型U87(U87-WT)细胞,并且TMZ可诱导U87-WT细胞中CtIP和PAXX的表达上调;在CtIP敲除(CtIP-/-)U87细胞中,NHEJ效率显著降低;而在PAXX敲除(PAXX-/-)U87细胞中,BER效率显著降低,铁死亡增加。铁死亡在肿瘤的发生和治疗中起到关键作用,特别是近年来在肿瘤耐药机制中的作用逐渐受到关注,这些实验结果,暗示我们CtIP和PAXX在耐药性机制中扮演重要角色。进一步研究,揭示了CtIP与DNA Ligase IV以及PAXX与DNA polβ之间的相互作用;细胞生长实验表明,抑制CtIP和PAXX表达可以逆转脑胶质瘤细胞的TMZ耐药性。本研究旨在探索GBM中TMZ耐药性的分子作用机制及潜在靶点,发现了GBM中TMZ耐药性的关键调控蛋白CtIP和PAXX,阐明了GBM中TMZ耐药性的分子机制,为GBM的治疗提供了新的潜在靶点,有望增强TMZ的疗效并逆转耐药性,为改善GBM患者的预后提供新的方法和选择。今后的研究将继续深入探讨CtIP、PAXX和SLC7A11在GBM中的异常表达对诊断和治疗的潜在价值,以及铁死亡在GBM耐药性中的具体作用和调控机制。

花椒(Zanthoxylum bungeanum)是芸香科(Rutaceae)花椒属(Zanthoxylum)的一种芳香植物,原生于中国,是我国传统香辛料之一,因具有独特麻味和浓郁香气而深受消费者喜爱。但花椒在食用时会感知到一定苦味。随着对花椒的食用和加工需求日益增加,我国花椒种植规模和范围不断攀升,随之而来的是诸如品种混乱、掺杂使假、技术滞后、产业链不完整等问题。这些问题也导致花椒的品质良莠不齐,苦味产生现象愈发突出,其中尤以青花椒(Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc)果皮苦味表现更甚。消费者通常很抗拒食物中的苦味,因而苦味逐渐成为阻碍青花椒消费与发展的因素之一。明确青花椒果皮中苦味的来源和苦味代谢物的形成机理成为一项亟需攻克的任务。鉴于此,本研究以苦味表现较为突出的重庆江津九叶青花椒为试验材料,首先研究了不同生长期青花椒果皮的成分与风味特征;接着结合苦味感官评价与代谢组学技术监测了青花椒果皮在生长过程中的苦味变化并筛选出苦味代谢物,进而采用高效液相色谱法测定了青花椒果皮中重点苦味代谢物的含量变化;最后,通过代谢组学和转录组学,组合并解析青花椒果皮苦味代谢物的重点代谢通路及其调控基因。主要研究结果如下:1、不同生长期青花椒果皮的成分和风味特征研究。七月中旬采摘的江津九叶青花椒果皮呈现出最为鲜艳、明亮的绿色外观,醇溶抽提物、不挥发性乙醚抽提物、总黄酮(123.38 mg·RE/g)和总酚(53.66 mg·GAE/g)含量丰富。同时,青花椒果皮的山椒素和挥发油在七月中下旬快速积累,并且其麻味和香气的主要贡献成分——羟基-α-山椒素和芳樟醇均在七月中旬积累至峰值含量115.89 mg/g和256.02 mg/m L,赋予了此阶段青花椒果皮最为突出的麻香风味品质。综合来看,七月中旬是江津九叶青花椒的合适采摘期。然而,通过苦味感官评价发现,青花椒果皮在生长成熟过程中苦味逐渐加重,并且在七月中旬苦味强度达到最高,推测随着青花椒生长代谢的进行,青花椒果皮中会积累苦味物质。2、不同生长期青花椒果皮的代谢组学分析与苦味代谢物动态积累研究。基于不同生长期青花椒果皮的代谢组分析,共筛选出93种对青花椒果皮的苦味具有潜在贡献的苦味代谢物。其中,在不同生长期差异积累的苦味代谢物主要富集于次生代谢物生物合成、苯丙氨酸代谢、苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成等代谢通路。对18种重点苦味代谢物的含量和苦味味觉活性值(Taste activity value,TAV)动态变化进行了测定,有11种苦味代谢物(熊果苷、表儿茶素、金丝桃苷、异槲皮苷、伞形酮、番石榴苷、槲皮素、槲皮苷、山奈酚、异鼠李素、原花青素B2)的TAV在各生长期均大于1,对苦味具有显著贡献;除表儿茶素和原花青素BTamoxifen2外的大多数苦味代谢物均在青花椒坐果期呈现出低TAV,而在成熟阶段呈现高TAV,与苦味强度呈正相关;金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、山奈酚和异鼠李素的TAV>10,并且均在七月中旬达到最大值,是成熟青花椒果皮苦味的主要来源。3、不同生长期青花椒果皮的转录组学分析与苦味代谢物生物合成途径研究。不同生长期青花椒果皮中的差异表达基因(Differential expression genes,DEGs)主要富集于代谢途径、次生代谢生物合成、苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、植物激素信号传导、淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢、光合作用、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成和苯丙氨酸代谢等生物代谢途径。权重基因共表达网络分析(Weighted gene coexpression network analysis,WGCNA)结果表明PAL、C4H、4CL、COMT、F5H、F6H、F3H、F3’5’H、F3’H、DFR、ANS、ANR和FLS等13个结构基因家族的表达情况与青花椒果皮中苦味代谢物的动态积累相关性强,是调控苦味形成的潜在表达基因。基于此,组合了一条主要由“苯丙烷生物合成”、“类黄酮生物合成”和“黄酮和黄酮醇生物合成”组成的青花椒果皮重点苦味代谢物生物合成途径。4、不同生长期青花椒果皮转录因子与苦味形成相关基因的相关性研究。b HLHs和MYBs是不同生长期青花椒果皮中差异表达数量最多的转录因子,差异表达的b HLHs和MYBs与29个DEGs(包括8个COMT、2个ANS、1个ANR、7个4CL、6个PAL、1个F3H、1个DFR、1个F3’H、1个F3’5’H和1个C4H)Pearson相关系数>0.90,表现出高度的共表达相关性。这些MYBs和b HLHs是影响青花椒果皮苦味形成Biomaterials based scaffolds相关基因表达的重要转录因子,与青花椒果皮苦味代谢物生物合成途径密切相关。综上所述,本研究确定了江津九叶青花椒的合适采摘时期;丰富了不同生长期青花椒果皮的代谢组和转录点击此处组信息;明确了青花椒果皮苦味形成关键时期及苦味代谢物的形成过程,金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、山奈酚和异鼠李素是成熟青花椒果皮苦味的主要来源;组合了一条主要由“苯丙烷生物合成”、“类黄酮生物合成”和“黄酮和黄酮醇生物合成”构成的青花椒果皮重点苦味代谢物生物合成途径。

血管性认知障碍（vascular cognitive impaiLiraglutide临床试验rment，VCI）是由脑血管病危险因Protein Characterization素、明显或不明显脑血管病引起的，涵盖从轻度认知障碍到痴呆的一大类综合征，其发病率呈现出逐年上升的趋势，严重威胁老年生活质量。调节性细胞死亡（RCD）是可调控的细胞死亡方式，包括细胞程序性坏死、自噬、细胞焦亡等多种形式，拥有独特的生化、形态特征。研究证实，缺血条件下调控RCD可促进细胞生存、减少神经细胞死亡，https://www.selleck.cn/products/BafilomycinA1.html在延缓VCI的发生发展中具有较大的作用。化学药治疗VCI主要针对改善血管风险因素及对发展到痴呆阶段后的认知能力干预，使用临床已成熟的药物较多，用药安全，但药效一般，对神经细胞的RCD调控较少。临床上也广泛使用中医药治疗VCI，疗效较好，但尚未明确其具体机制，与RCD的关系也缺少相关总结。综述VCI中铁死亡、细胞焦亡、线粒体自噬及依赖性细胞死亡等不同形式RCD的研究进展，以及中医药对RCD的调控，对VCI的治疗作用，以期为探索临床VCI治疗的潜在靶点提供新的视角。

目的探讨天冬氨酸转氨酶-血小板计数比值指数（aspartate aminotransferase-platelet ratio index,APRI）与肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）射频消融（radiofrequency ablation,RFA）治疗后肿瘤复发的关系。方法 纳Epstein-Barr virus infection入2017年1月至2020年12月江苏大学附属武进医院初诊为HCC并接受RFA治疗的患者204例。采用受试者工作特征（receiver operation characteristics, ROC）曲线确定APRI的最佳截断值。绘制Kaplan-Meier曲线计算高、低APRI组患者的无复发生存期（recurrence-free survMK-1775半抑制浓度ival,RFS）。Cox回归分析RFA后HCC复发的独立预测因素，并选择显著变量构建列线图模型。通过一致性指数（concordance index,C-index）和校正曲线评价列线图模型对HCC复发的预测能力。结果 RFA治疗后HCC复发率为57.4%(117/204)。APRI预测HCC复发的最佳截断值为0.501，曲Compound 3分子式线下面积（area under curve,AUC）为0.678 (95%CI:0.603～0.752)。高APRI组（≥0.501）121例，低APRI组（<0.501）83例，高APRI与患者低RFS显著相关（χ2=12.929, P<0.01）。Cox回归分析证实，肿瘤数目（HR=1.541, 95%CI:1.039～2.286, P=0.031）、肿瘤最大直径（HR=1.461, 95%CI:1.011～2.112, P=0.044）、血清AFP(HR=2.286,95%CI:1.576～3.318, P<0.01)和APRI(HR=1.873, 95%CI:1.257～2.790, P=0.002)是HCC复发的独立风险因素。基于以上4个因素构建预测RFA治疗后HCC复发的列线图模型，C-index为0.769 (95%CI:0.676～0.862)，预测1年、2年和3年RFS的AUC分别为0.707、0.719和0.707。校正曲线展示模型预测与实际复发风险之间具有良好一致性。结论 基于APRI与肿瘤生物学特征的列线图模型对HCC复发具有良好预测能力。

黑腐LGK-974价格皮壳菌(Valsa mali引起的苹果树腐烂病在我国各苹果主产区可造成严重危害,是确认细节制约苹果产业可持续发展的主要限制因子。微生物的铁稳态主要通过调节铁的吸收、储存和解毒来保证充足的铁供应并预防铁积累毒性,在真菌中,铁载体-铁转运蛋白(SITs)主要通过ABC转运蛋白和MFS转运蛋白进行运输,对于植物和动物病原菌而言,铁载体-铁转运蛋白在其致病过程中起至关重要的作用。铁载体-铁转运蛋白属于MFS家族,具有底物特异性,是真菌界独有的一个蛋白家族。目前关于苹果树腐烂病菌铁载体-铁转运蛋白的研究较少。课题组在苹果树腐烂病菌转录组测序结合基因表达分析发现,腐烂病菌侵染致病过程中有1个铁载体-铁转运蛋白基因VmSit1显concomitant pathology著上调表达。通过qRT-PCR荧光定量发现腐烂病菌VmSit1基因表达水平在接种富士苹果枝条24 h、48 h后显著升高,推测其在腐烂病菌致病过程中可能发挥重要作用。笔者课题组通过PEG介导的原生质体转化法获得苹果树腐烂病菌基因VmSit1的两个敲除突变体菌株ΔVmSit1-52、ΔVmSit1-59。通过在PDA、CDM和ABM培养基和富士苹果枝条、叶片的接种试验,发现ΔVmSit1敲除突变体菌落形态和生长速率均无明显变化,但枝条和叶片的致病力显著降低。使用铁含量测定试剂盒测定YEPD培养基摇培48 h后ΔVmSit1敲除突变体菌丝铁含量显著降低,通过铬天青S比色法测定恰佩克培养基摇培96 h后ΔVmSit1敲除突变体相对铁载体含量显著上升。本研究首次对苹果树腐烂病铁载体-铁转运蛋白VmSit1基因进行初步研究,结果表明VmSit1基因是苹果树腐烂病菌的重要致病因子,VmSit1基因可能是通过调节铁载体-铁转运蛋白转运影响细胞铁含量调控这一过程。继续研究其基因功能,有望为苹果树腐烂病防治提供理论基础。

香蕉枯萎病是我国香蕉生产中危害最大，且难以防治的一种真菌病害，由于香蕉枯萎病的影响，我国近年来香蕉种植面积逐年减少，给我国亚热带、热带香蕉产业造带来了巨大的经济损失。该病害是由于香蕉的维管束受到病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. Cubense，Foc）入侵而发生，其繁殖速度快，引起香蕉叶片黄化和植株萎蔫。通过比较尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种（Foc1）N2菌株和4号生理小种（Foc4）B2菌株的基因组及转录组序列，分选出位Oral immunotherapy于特异编码selleck区段并且表达量较高的分泌蛋白FoSP1。本实验研究结果表明FoSP1基因开放阅读框为390 bp，编码129个氨基酸，其信号肽切割位点位于第20～21位氨基酸残基之间，且该蛋白无任何已知的结构域和功能位点，因此推断出FoSP1是一个新的分泌蛋白。为了研究该蛋白在Foc4侵染香蕉过程中的具体作用，本研究利用split-marker的方法敲除了Foc4的FoSP1基因，并对获得的正确敲除突变体进行表型分析和致病性测定。结果表明，相比野生型B2菌株，FoSP1基因敲除突变体菌丝的营养生长无显著差异，对NaCl、山梨醇和H_(2)0_(2)等外源胁迫均表现不敏感，但敲除突变体产孢量和分生孢子萌发率显著降低，且对巴西蕉苗的致病力明显减弱。由此推测分泌蛋白FoSP1不参与Foc4菌株B2的营养PR-171 IC50生长，但在其产孢、侵染寄主植物及致病的过程中发挥着重要作用。此结果为进一步研究Foc4分泌蛋白的功能奠定了基础。

目的：研究佛甲草正丁醇提取物抗炎、镇痛作用，并初步探讨其机制。方法：采用selleck LXH254二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀急性炎症模型、小鼠肉芽增生慢性炎症模型、完全弗氏佐剂诱导的大鼠关节炎模型、坐骨神经分支结扎所致的大鼠神经病理性疼痛模型、冰醋酸诱导的小鼠疼痛模型和热辐射痛模型，检测小鼠胸腺指数、脾脏指数、足趾肿胀度、耳廓肿胀率、热缩足反应、机械缩足反应、扭体次数、甩尾时间，酶联免疫学方法检测小鼠血清IL-10和IL-6含量，化学比色法检测SOD、GSH-Px和MDA含量。结果：佛甲草正丁醇提取物能有效减轻小鼠耳廓肿胀度、棉球所致的肉芽肿增生及佐剂性关节炎大鼠足趾肿胀度（P<0.Barasertib体内实验剂量05）；明显提高神经病理性痛大鼠机械痛阈值（P<0.01），显著延长辐射热引起的小鼠疼痛甩尾反应潜伏期（P<0.001），抑制冰醋酸刺激小鼠腹腔黏膜引起的疼痛反应（P<0.01）；下调小鼠脾及胸腺指数（P<0.01）；降低小鼠血清IL-6和MDA含量（P<0.01），升高IL-10(P<0.01)、SOD及GSH-px含量（P<0.05）。结论：佛TB and other respiratory infections甲草正丁醇提取物具有抗炎镇痛作用，其作用机制可能与调节机体免疫功能、抑制炎症反应和抗氧化功能有关。

目的 探讨柴芩感冒退热颗粒治疗病毒性感冒的分子关联机制。方法 2021年12月至2022年1月借助整合药理学平台V 2.0版本软件的分析功能，建立柴芩感冒退热颗粒治疗病毒性感冒的多维网络，并将核心成分与关键靶标进行分Surgical Wound Infection子对接可视化处理。结果 分析发现柴芩感冒退热颗粒治疗病毒性感https://www.selleck.cn/products/Bleomycin-sulfate.html冒的干预作用可能与Raf激酶抑制蛋白（RKIP）/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号级联、蛋白磷酸酶2A(PP2A)和即刻早期反应基因（IER3）调节胞内磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/蛋白激酶B(AKT)信STM2457小鼠号通路、核受体转录通路、中性粒细胞脱颗粒、FCER受体Ⅰ（FCERⅠ）介导核因子kB(NF-kB)活化、内源性甾醇、磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PI-3,4,5-P3,PIP3）激活AKT信号的调节等有关，并通过分子对接发现化合物香蜂草苷、甘草酸等与靶蛋白作用力较强的化合物分子。结论 柴芩感冒退热颗粒通过多种活性成分、多靶点、多通路相互作用发挥治疗病毒性感冒作用。

微生物灭活作为鲜切菜加工过程中关键的步骤之一,关系着鲜切菜的保质期与食品安全问题。因此,研究和利用各种除菌技术以延长鲜切菜保鲜期、保证食品安全与质量十分重要。光动力抗菌技术(photodynamic antimicrobialtechnology,PDAT)是一LGK-974种新兴的食品非热除菌技术手段,利用光生的活性氧自由基(reactive oxygenspecies,ROS)攻击微生物细胞的多个靶点,不易产生耐药性,在鲜切菜领域展现出了巨大的应用前景,为当前研究的前沿热点。考虑到鲜切菜本身具有的生理活性Peri-prosthetic infection成分与光敏剂之间的相互作用,SB431542分子式相比离体实验,PDAT在鲜切菜中的应用效果有限,应将其视为额外的除菌工具,而不是其他传统除菌技术的替代品。本文以鲜切菜的食品安全为出发点,综述了PDAT的原理、方法优势及劣势,鲜切菜的代谢生理变化与PDAT在鲜切菜领域上的应用研究进展与未来发展方向,以期为促进净菜产业的食品安全和PDAT的发展提供依据。

蓝靛果(Lonicera Caerulea L.),又称蓝靛果忍冬、蓝果(忍冬),俗称山茄子、羊奶子、黑瞎子果等,为忍冬科忍冬属灌木类浆果植物。蓝靛果果实富含花青素和Software for Bioimaging其他营养成分,且风味独特,被誉为“第三代水果”;蓝靛果花青素为黄酮类多酚化合物,在抗衰老、抗氧化等方面具有显著的效果。因此,开发利用蓝靛果种质资源具有广阔的市场前景。本试验在分析不同蓝靛果品种的花青素组分与含量基础上,结合综合性状表现,筛选出适用于花青素合成代谢中关键酶结构基因研究的种质材料,通过对结构基因克隆与分析进一步了解其遗传信息,为创制新种质与培育高含量花青素蓝靛果新品种提供理论依据。通过对10个不同品种(XL1、ZL1、ML3、X-8、X-10、2-1、3-1、6-1、06-2、06-4)及其不同时期蓝靛果果实花青素定性与定量分析表明,不同品种、不同时期花青素含量与组分显著不同。在果实完全转色期最多检测出9种花青苷组分,分别为矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-芸香糖苷、芍药素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-芸香糖苷。每100 g蓝靛果果实中花青苷含量为262 mg-821 mg。在9种花青苷中,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量占总花青苷含量的80%-87%,远远高于其它8种花青苷,说明蓝靛果果实中的花青苷主要以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为主,可以作为提取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的植物材料。蓝靛果幼果期(S1)、绿熟期(S2)、开始转色期(S3)、半转色期(S4)和完全转色期(S5)果实花青苷测定结果表明,S1、S2中未检测到花青苷,S3、S4和S5中花青苷种类分别为4种、6种、8种,每100g蓝靛果鲜果中花青苷含量分别为11.17±0.67 mg、100.45±2.11 mg、300.89±4.86 mg。说明果实越成熟,颜色越深,花青苷种类越多,含量越高。同时,采用第二代测序技术,基于Illumina测序平台对不同成熟期(S2、S4和S5)蓝靛果果实进行转录组测序,分析差异表达基因,筛选出蓝靛果花青素合成关键酶结构基因。对蓝靛果S2、S4KD025使用方法、S5果实进行转录组测序得到150 109个转录本,58 362个Unigene,其中,有6 005(10.29%)个Unigene与己知的6大公共数据库(NR、GO、KEGG、Pfam、egg NOG、Swissprot)均有匹配。对差异表达基因进行分析,共筛选出花青素合成关键酶结构基因19条,分别为:PAL 6条、C4H 2条、CHS3条、CHI 1条、F3H 1条、F3′H 1条、DFR 1条、ANS 1条、UFGT 3条。成功克隆了LcDFR基因,并构建pPICZαB-LcDFR表达载体。LcDFR基因全长为1 191 bp,编码396个氨基酸。对该蛋白进行生物信息学分析:LcDFR蛋白的分子式为C_(1981)H_(3092)N_(518)O_(590)S_(18)、相对分子质量为44.18 k D,理论等电点为5.70,含有一个保守结构域PLN02650,不稳定指数为33.66、平均疏水性为-0.243,属于稳定亲水性蛋白质,LcDFR蛋白无信号肽,但含有1个跨膜区,为非分泌型跨膜蛋白,该蛋白在细胞质、细胞核和内质网中的概率极大。蛋白结构分析发现,LcDFR蛋白主要由无规则卷曲组成。系统进化分析表明,LcDFR与大丽花、百日菊、黄花蒿、矢车菊、雪莲花亲缘关系较近,与小粒咖啡、茶树、红花油茶、欧selleck合成洲越桔、北高丛越桔亲缘关系较远。将pPICZαB-LcDFR表达载体进行线性化后转入毕赤酵母,通过zeocin抗性平板进行菌株筛选,挑取单菌落进行菌落PCR鉴定,对阳性菌株进行培养,成功获得转基因毕赤酵母。