RAF信号通路

单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)是一种致死率较高的食源性病原菌,依赖于多种表面蛋白促进对宿主感染。Lm表面蛋白主要分为共价结合蛋白,非共价结合蛋白和膜锚定蛋白,它们通过特定的相互作用附着在细胞壁上。壁磷壁酸(Wall teichoic acids,WTAs)是细胞壁表面最丰富的糖聚合物,参与细菌表面蛋白的锚定,进而调节细菌形态、自溶和毒力。WTAs结构是细菌菌体抗原的基础。在李斯特菌中,WTAs分为两种类型,分别是以鼠李糖或N-乙酰葡萄糖胺修饰的Ⅰ型WTAs(血清型1/2、3和7)和以葡萄糖/半乳糖进一步修饰N-乙酰葡萄糖胺的Ⅱ型WTAs(血清型4、5和6)。目前已经揭示鼠李糖修饰的Ⅰ型WTAs通过GW(glycine-tryptophan)结构域促进InlB和Ami在细胞表面的有效保留,介导细菌的自溶活性和毒力。此外,半乳糖基化的Ⅱ型WTAs对毒力蛋白InlB的表面锚定同样至关重要。GW结构域广泛存在于革兰阳性细菌中参与表面蛋白的锚定,但其与糖基化修饰WTAs之间的具体结合机制有待深入研究。前期从暴发李斯特菌病病例的羊脑中分离获得Lm XYSN菌株,经基因组学比较分析,发现其与谱系Ⅱ的血清型1/2a菌株具有较近的遗传地位。为了揭示Lm XYSN高毒力的分子致病机制,构建了转座突变库,以人结肠癌上皮细胞为体外模型,对毒力相关基因进行了高通量筛选。LMxysn_1095::Tn对Caco-2BBe细胞系的侵袭力显著下降,对小鼠的毒力相比野生株降低了 105倍。进一步分析提示LMxysn_1095基因(galT)所在的基因簇有可能参与WTAs糖基化修饰,而该基因在细菌毒力中的分子作用机制还有待阐明。本研究以Lm XYSN为生物材料,研究了其菌体和鞭毛抗原以及毒力表型;解析了 Lm XYSN菌株的WTAs结构及galT在WTAs糖基化修饰过程和毒力中的作用;探究了独特的WTAs结构与毒力蛋白锚定的锚定机制并初步明确了 LygA蛋白的生物学功能;通过小鼠模型评价了ΔgalT缺失株作为减毒活疫苗的保护性免疫应答。本研究有助于揭示血清型4h菌株独特的WTAs结构在李斯特菌致病中的作用机制,同时为李斯特菌病的预防和治疗提供理论基础。1.新现血清型4h单核细胞增生李斯特菌的毒力评价玻板凝集试验结果显示Lm XYSN的菌体抗原是4型,鞭毛抗原与H-A和H-B凝集,不与H-C反应。因其不同于现有13种血清型的组合,该类菌株的血清型被命名为新的血清型4h。利用结肠癌上皮细胞系Caco-2BBe测定了血清型4h菌株(Lm XYSN、Lm 16E和Lm 15LG)与强毒参考菌株的细胞侵袭能力。结果显示血清型4h菌株的细胞侵袭能力均显著高于其它所有Lm菌株。同时,以相同剂量感染C57BL/6小鼠,血清型4h菌株在多个脏器中的定殖能力均显著高于其它参考菌株,并在3-5天内引起小鼠死亡。以1×109 CFU灌胃感染豚鼠结果显示,Lm XYSN感染组豚鼠全部死亡,而Lm EGD-e感染组均存活。这些结果表明血清型4h菌株具有较高的毒力。对易感宿主湖羊灌胃感染Lm XYSN和Lm EGD-e,监测6d内湖羊的体温体重变化。结果显示Lm XYSN感染组湖羊与空白组的相比体温上升,体重下降,而Lm EGD-e感染组相对稳定。同时,Lm XYSN在肝脏和肠道中的定殖能力比Lm EGD-e高158-426倍。Lm XYSN先后突破肠道屏障和血脑屏障引起胃肠炎和脑膜炎等典型的羊李斯特菌病,导致湖羊在感染21-39天内全部死亡。在感染早E7080 molecular weight期,Lm XYSN抑制湖羊脾脏、肝脏和肠系膜淋巴结中IFN-γ、TNF-α和IL-6的表达。此外,通过ELISA测定感染不同时间点外周血中IFN-γ的含量,结果显示相较于Lm EGD-e感染组,在感染第1 d和第2 d,Lm XYSN显著抑制了湖羊体内IFN-γ的分泌。这些结果表明血清型4h菌株在感染早期显著抑制体内促炎因子的表达,从而促进细菌在体内的生存与致病。2.半乳糖基转移酶基因galT增强李斯特菌毒力的作用机制LMxysn_1095基因(galT)被预测为功能未知的糖基转移酶,其所在的基因簇有可能参与WTAs糖基化修饰。为此,通过电喷雾质谱解析了野生株和ΔgalT缺失株的WTAs结构,结果显示Lm XYSN的WTAs上仅有半乳糖基修饰,属于Ⅱ型WTAs(Gal-WTAs)。而galT基因的缺失导致WTAs上的半乳糖基缺陷,提示该基因编码半乳糖基转移酶(Galactosyltransferase,GalT),参与WTAs上的半乳糖基修饰。玻板凝集试验显示ΔgalT缺失株不能与菌体抗原的Ⅳ型Lm鉴定血清凝集,表明半乳糖基化WTAs是细菌菌体抗原的基础。透射电镜结果显示,ΔgalT缺失株的细胞壁结构改变。在对抗菌肽LL-37和CRAMP的耐受试验中,ΔgalT缺失株的生存能力显著降低。这些结果表明半乳糖基化WTAs通过维持细胞壁结构的完整性增加细菌对抗菌肽的抵抗力。提取细菌的细胞壁蛋白和分泌蛋白,通过WB分析毒力蛋白在细胞表面的定位。结果显示InlB、Ami和ActA蛋白从ΔgalT缺失株细胞表面脱落。同时,利用ActA抗体标记感染细胞的细菌,结果显示ΔgalT缺失株不能聚集宿主肌动蛋白,限制了其在细胞间的扩散,而野生株和回复株的细菌末端均能形成明显的哈雷彗星样尾巴。这些结果表明半乳糖基化WTAs通过促进毒力蛋白InlB、Ami和ActA的有效锚定,介导细菌毒力。以Caco-2BBe为细胞感染模型的试验结果显示,galT基因的缺失不影响细菌的黏附能力,但显著降低了细菌的侵袭和胞内增殖能力。细菌在小鼠脏器中的定殖能力测定结果显示,ΔgalT缺失株仅低剂量定殖于部分回肠中(72.44 CFU/g),而野生株和回复株在脏器中的细菌载量均处于较高水平(103-105 CFU/g)。此外,LD50测定结果显示ΔgalT缺失株的LD50相比于Lm XYSN增加了 105倍。这些结果充分表明galT基因是重要的毒力相关因子,促进细菌突破肠道屏障并定殖于肝脏和脾脏中。3.半乳糖基化壁磷壁酸与自溶素LygA互作介导细菌稳态和毒力提取Lm XYSN和ΔgalT菌株的细胞壁蛋白,利用定量蛋白组学分析进一步挖掘受半乳糖基化WTAs调控的表面蛋白,结果显示除InlB和Ami外,ΔgalT缺失株细胞表面一种新的GW结构域蛋白LMxysn_1092(LygA)蛋白含量降低了 24.42倍。qRT-PCR试验显示野生株和ΔgalT缺失株中lygA的转录水平相似,且WB结果证明大量LygA从ΔgalT缺失株细胞表面脱落。这些结果表明半乳糖基化WTAs对于LygA在细胞表面的有效锚定至关重要。为了探究LygA与WTAs之间的相互作用,将纯化的LygA蛋白偶联在CM5芯片表面,分别用Lm XYSN、ΔgalT和ΔgdlT::galT菌株的WTAs作为分析物,通过表面等离子共振技术(SPR)测定两者之间的结合能力,结果显示LygA与Gal-WTAs的亲和力(KD=1.54μM)显著高于其与半乳糖基化缺陷型WTAs的亲和力(KD=7.61μM)。同时,LygAGW蛋白与WTAs的SPR试验结果显示,其与Gal-WTAs的相互作用显示出与LygA相同的趋势,且在WTAs浓度相同的条件下,LygAGW与WTAs的结合能力更强。此外,通过WB分析GW基序数量对于LygA锚定的影响,结果显示随着GW结构域数量的持续减少,LygA逐渐从细胞壁表面脱落,尤其是当4个GW结构域被敲除时,LygA几乎失去了锚定能力。总之,这些结果表明LygA在细胞表面的完整保留通过C末端固定数量的GW基序与WTAs以Gal依赖的方式结合。此外,不受WTAs鼠李糖基化影响的Auto蛋白与Gal-WTAs具有较强的相互作用(KD=0.08 μM)。经氨基酸比对分析发现,Auto蛋白中的GW结构域与LyPF-03084014价格gA蛋白中的GW结构域同源性相对较低。这些结果表明WTAs与GW蛋白的结合能力取决于GW基序特定的氨基酸序列和WTAs糖基化模式的多样性。为了进一步探究LygA蛋白的功能,通过SMART软件分析显示LygA是由LYZ2和GW结构域组成的自溶素。利用溶壁微球菌测试了 LygA蛋白的水解酶活性,结果显示LygA的酶活为211 U,其可能改变了溶壁微球菌表面的疏水性,致使细胞大量聚集。受WTAs糖基化调控表面结合的自溶素Ami促进细菌的自溶。为了测试LygA在细菌自溶中的作用,成功构建了 ΔlygA、Δami和ΔlygA/ami缺失株。自溶活性测定结果显示在34h之内,ΔlygA缺失株的自溶生理水平略高于ΔlygA/ami双缺失株,但显著低于Δami缺失株。此外,蛋白组学分析显示LygA在细胞表面的含量显著高于Ami在细胞表面的含量。这些结果表明半乳糖基化WTAs借助于细胞壁表面的自溶素LygA和Ami促进细菌的自溶,其中LygA占主导作用。为检测LygA在细菌毒力中的作用,以Caco-2和HepG-2细胞评估了其对上皮细胞的黏附和侵袭能力,结果显示野生株和回复株相比于ΔlygA缺失株具有更高的黏附和侵袭能力。在小鼠灌胃感染模型中,LygA的缺失显著降低了细菌在肝脏、结肠和大脑中的定殖能力。这些结果表明LygA是Lm毒力所必需的,参与细菌在肠道的早期定殖和对宿主的进一步感染。4.ΔgalT减毒活疫苗候选株的保护性应答研究以C57BL/6小鼠为模型,皮下接种Lm XYSN和ΔgalT缺失株,评价候选疫苗的安全性,结果显示ΔgalT缺失株在肝脏和脾脏中的细菌载量均显著低于Lm XYSN感染组,并能在短时间内被机体快速清除。此外,免疫后小鼠各脏器的组织病理学分析显示,ΔgalT缺失株免疫组与PBS免疫组一样,各脏器均无病理学变化。这些结果表明ΔgalT缺失株作为减毒活疫苗具有较高的安全性。利用ELISA检测疫苗候选株免疫后小鼠体内抗体的变化规律,结果显示ΔgalT缺失株在免疫14 d后,诱导了抗Lm XYSN抗体,且抗体滴度逐渐增加,在免疫后21 d达到峰值。同时,在免疫后21 d对小鼠脾脏中细胞因子的转录水平进行测定,结果显示ΔgalT缺失株诱导Th1倾向的细胞因子IFN-y、TNF-α、IL-6和IL-17的高水平表达。重要的是,以致死剂量的Lm XYSN对免疫28 d后小鼠进行攻毒,结果显示ΔgalT缺失株能为小鼠提供100%免疫保护,且在免疫后105 d仍可提供83.3%的保护效率。这些结果表明ΔgalT缺失株可作为减毒活疫苗候选株,刺激机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫应答,从而介导高水平免疫保护。综上所述,Lm XYSN为新现强毒株,对多种动物具有高致病力,基于其特有的菌体抗原和鞭毛抗原特征被新命名为血清型4h菌株。Lm XYSN的WTAs上仅有半乳糖基修饰,为Ⅱ型WTAs。galT基因参与WTAs上的半乳糖基修饰,并介导重要毒力蛋白InlB、Ami和ActA的表面锚定。同时,新发现的LygA自溶素通过一定数量的GW结构域与Gal-WTAs直接相互作用,调节细菌稳态和毒力。此外,ΔgalT缺失株作为减毒活疫苗候选株可高效保护同源型菌株的攻击。本研究揭示了独特的Ⅱ型WTAs在血清型4h菌株毒力增强中的作用机制,其可作为潜在的药物靶标,history of oncology对李斯特菌病的预防和控制具有重要意义。

2020年8月在福建海域用底拖网捕获雌莱氏拟https://www.selleck.cn/products/stm2457.html乌贼Sepioteuthis lessoniana 7尾，未性成熟个体2尾，平均体质量（210±43）g，已性成熟个体5尾，平均体质量为（430±76）gMedicina perioperatoria，用组织切片技术观察其卵巢的显微组织学结构，根据卵子的发生特征和变化规律划分卵子发生时期。结果显示：莱氏拟乌贼卵巢内的卵原细胞个体逐渐增大，细胞核由中央偏向一端直至消失；扁平状滤泡细胞和椭圆形滤泡细胞先后包裹卵母细胞，双层滤泡细胞在卵母细胞内增多并形成指状突起；卵黄物质在滤泡细胞解体时形成，最终充满卵母细胞。根据以上特征，将莱氏拟乌贼的卵子发生划分为4个阶段9个时期，即SB203580采购第一阶段卵原细胞期，第二阶段无滤泡细胞期、单层滤泡细胞期和双层滤泡细胞期，第三阶段滤泡细胞增生初期、滤泡细胞增生中期和滤泡细胞增生末期，第四阶段卵黄堆积期及成熟期。本研究认为莱氏拟乌贼卵子内的滤泡细胞起到合成并分泌营养物质的功能。

目的 分析探讨血清炎症因子以及血小板指标对颅内感染的诊断价值。方法 回顾性分析2018年1月至2022年12月于我院神经外科行开颅手术的326例患者的临床资料，按照术后是否发生颅内感染分为颅内感染组(31例)与非颅内感染组(295例)。收集患者术后第1天、第3天、第7天空腹静脉血5 mL,检测并比较两组患者的血清炎症因子和血小板指标，建立血清炎症因子、血小板指标诊断颅内感染的受试者工作特征曲线(ROC),分析其诊断效果。结果 颅内感染组与非颅内感染组患者在开颅术后第1天血清各炎症因子及血小板指标水平无明显差异(P>0.05);颅内感染组开颅术后第3天的血清PCT、CRP、TNF-α水平明显高于非颅内感染组(P<0.05);颅内感染组与非颅内感染组患者在开颅术此网站后第3天血清WBC、IL-6水平无明显差异(P>0.05);颅内感染组开颅术后第7天的血清WBC、IL-6、PCT、CRP、TNF-α水平明显高于非颅内感染组(P<0.05)。颅内感染组开颅术后第3天的PLT水平明显低于非颅内感染组(P<0.05);两组患者在开颅术后第3天MPV水平无明显差异(P>0.05);颅内感染组开颅术后第7天的血清MPV与PLT水平明显高于非颅内感染组(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示，血清炎症因子和血小板指标在开颅术后第1天对颅内感染诊断价值较差(P>0.05);血清PCT、CRP、TNF-α、PLsynthetic immunityT在开颅术后第3天对颅内感染诊断价值有统计学意义(P<0.05)ATPase抑制剂;血清炎症因子和血小板指标在开颅术后第7天对颅内感染诊断价值有统计学意义(P<0.05)。结论 在实施开颅手术后对患者的血清炎症因子水平以及血小板指标进行定期检测对于术后颅内感染的具有一定诊断价值。

目的:我们Biomass deoxygenation先前的研究表明,脾脏切除后免疫水平降低,导致骨折愈合减慢,本文拟探讨外伤性脾破裂导致脾脏切除后患者免疫功能改变对骨质疏松症的影响。研究方法:本研究开始于2020年9月,截止于2022年12月,研究期间,收集中国医科大学附属盛京医院2016年1月-2021年6月门诊就诊及病房收治的创伤性脾脏切除患者28例,其中男性17例,女性11例,平均年龄(48.57±9.35)GSK J4体内实验剂量岁,为实验组;其他内脏切除(急性阑尾炎导致阑尾切除,肠绞窄坏死、肠破裂等非肿瘤性疾病导致肠切除)患者47例,其中男性24例,女性23例,平均年龄(51.13±3.88)岁,为对照组;健康患者25例,其中男性8例,女性17例,平均年龄(47.80±6.95)岁,为空白组。检测指标:(1)一般资料分析:分析实验组、对照组及空白组患者性别、身高、体重、年龄等基本资料;(2)骨密度检查:实验组28例、对照组47例、空白组25例患者骨密度(BMD)检查中骨矿含量、骨密度(g/cm2)值、T-值及Z-值水平;(3)调查问卷:对实验组、对照组、空白组患者进行问卷调查,分析比较实验组临床症状与骨质疏松症症状之间的相关性。(4)抽血化验检查:实验组12例、对照组10例、空白组10例,均来自完善骨密度检查患者,分析比较骨代谢标志物(BMMS)中的总I型胶原氨基端延长肽(TPINP)、β-胶原降解产物(CROSSL)、骨钙素(OSTEOC)及免疫因子中的白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素17(IL-17)、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等水平。结果:1.实验组、对照组及空白组患者身高、体重、性别、年龄等基本资料以及手术切除脏器与本研究检查间隔时间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。2.实验组骨密度学检查中,骨矿含量、骨密度(g/cm2)、T-值、Z-值低于对照组及空白组,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.实验组骨质疏松症相关症状问卷调查:“乏力症状”、“骨、关节、腰背痛”、“肌肉痉挛”、“摔倒、跌倒”与对照组及空白组相比,症状出现频率及程度明显升高,实验组乏力症状更重、感冒次数增加,患者免疫功能降低,更易出现骨质疏松症相关临床表现。4.实验组骨钙素(OSTEOC)与对照组、空白组相比,差异无统计学意义(P>0.05),实验组β-胶原降解产物(CROSSL)、总I型胶原氨基端延长肽(TPINP)明显高于对照组、空白组,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.实验组白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素17(IL-17)、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)与对照组、空白组比较,差异无统计学意义(P>0.05),实验组白细胞介素6(IL-6)明显高于对照组、空白组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.脾脏切除组患者骨密度学检查中骨矿含量、骨密度值、T-值、Z-值水平明显降低,患者骨质疏松症程度更重;2.脾脏切除组患者免疫功能降低,更易出现骨质疏松症临床表现;3.Fulvestrant半抑制浓度脾脏切除组患者参与骨代谢的免疫因子IL-6水平升高,骨流失作用增强;4.脾脏切除组患者CROSSL及TPINP水平明显升高,患者骨代谢活跃。

目的铁是人脑中最丰富的过渡金属。在健康成人大脑中铁的分布是不均匀的,在基底神经节中铁含量最高,而在灰质、白质、中脑和小脑中铁含量较低。随着年龄的增长,铁会沉积在大脑区域,如黑质(substantia nigra,SN)和苍白球。在各种神经退行性疾病中,如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)和帕金森病(Parkinson’s Disease,PD),铁在特定大脑区域沉积,并且铁稳态失调。溶酶体作为铁代谢的主要调节器,在细胞铁转运和稳态中起着关键作用。有研究报道小鼠腹腔给铁后,肝脏和脾脏中铁水平升高。但腹腔给铁后,外周组织(如肝脏和脾脏)铁过载对溶酶体功能的影响,以及外周铁能否进入大脑区域影响溶酶体功能和运动功能需要进一步探讨。方法本实验建立腹腔注射葡聚糖铁(iron dextran,FeDx)小鼠模型,C57BL/6小鼠腹腔注射FeDx(200 mg/kg),对照组给予等量生理盐水,隔天一次,给药时长分别为1周、2周、3周或4周。应用免疫印迹法检测肝脏、脾脏、海马(hippocampal,HC)、纹状体(striatum,STR)、黑质和嗅球(olfactory bulb,OB)的L型铁蛋白(ferritin enriched in L subunits,L-ferritin)、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(Cyl-Co A synthetase long-chain family member 4,ACSL4)和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4),同时检测了溶酶体相关蛋白的表达,如组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)、组织蛋白酶D(cathepsin D,CTSD)、葡萄糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase,GCase)、溶酶体整合膜蛋白2(lysosome integrated membrane protein 2,LIMP-2)和溶酶体相关膜蛋白1(lysosomal-associated membrCeralasertib使用方法ane proteins 1,LAMP-1)。应用铁含量测定试剂盒检测血清和脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)铁含量。应用免疫荧光染色和免疫组化染色检测多巴胺能神经元数量和纤维密度。应用步态分析评估小鼠的运动功能。结果1.腹腔注射FeDx 1周、2周、3周或4周后,与其对照组相比,肝脏和脾脏中L-ferritin水平显著升高,差异有统计学意义。肝脏和脾脏中ACSL4和GPX4蛋白水平在1-4周无显著差异。肝脏中CTSB、CTSD、GCase和LIMP-2蛋白水平在1-4周升高,差异有统计学意义。脾脏中CTSD、GCase和LIMP-2蛋白水平在1-4周升高,肝脏中CTSB蛋白水平在2-4周升高,差异有统计学意义。腹腔注射FeDx 1周后,肝脏中LAMP-1蛋白水平无明显变化,在2-4周时蛋白表达降低。结果提示,腹腔注射FeDx诱导小鼠肝脏和脾脏铁过载以及溶酶体功能障碍。2.腹腔注射FeDx 1周后引起血清铁浓度轻微升高,2-4周血清铁浓度随着给药周期而升高,差异有统计学意义。脑脊液中的铁浓度在1-4周时保持在定量限(limit of quantitation,LOQ)附近。结果提示,腹腔注射FeDx可导致血清铁浓度随时间依赖性升高,但脑脊液铁浓度没有明显升高。3.腹腔注射FeDx 1-2周,OB中L-ferritin蛋白水平升高,表明OB存在早期铁沉积,而HC和STR未观察到变化。腹腔注射FeDx 3-4周后,OB中L-ferritin蛋白水平下降至正常水平,HC和STR中L-ferritin蛋白水平升高。腹腔注射FeDx 3周或4周后,SN和STR的铁染色阳性细胞增加。结果提示,腹腔注射FeDx诱导OB、SN、HC和STR铁沉积。4.腹腔注射FeDx 1-4周,SN、HC和STR中CTSB和CTSD蛋白水平不变。腹腔注射FeDx 1-3周,OB中CTSB和CTSD蛋白水平保持不变,4周后OB中CTSB和CTSD蛋白水平下调,4周root canal disinfection后HC中LAMP-1蛋白水平降低。SN、HC、STR和OB中GCase和LIMP-2蛋白水平在1-4周无明显变化。结果提示,腹腔注射FeDx未引起OB、SN、HC和STR中明显的溶酶体功能障碍。5.经鼻给枸橼酸铁胺(Ferric ammonium citrate,FAC)两次后,OB中L-ferritin、CTSB、GCase和LIMP-2蛋白水平升高,CTSD和LAMP-1蛋白水平无显著差异。原代培养的腹侧中脑神经元/星形胶质细胞,经100μM FAC处理后,CTSB、CTSD、GCase、LIMP-2和LAMP-1蛋白水平无明显差异。原代培养的腹侧中脑神经元,经1 m M FAC处理后LIMP-2蛋白水平升高,而CTSB、CTSD、GCase和LAMP-1蛋白水平无显著差异。原代培养的腹侧中脑星形胶质细胞,经1 m M FAC处理后LIMP-2和LAMP-1蛋白水平升高,GCase蛋白水平无显著差异,CTSB蛋白水平升高。结果提示,FAC诱导OB和原代培养的腹侧中脑星形胶质细胞中CTSB表达上调,溶酶体功能受损。6.腹腔注射FeDx 4周后,STR中酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)纤维密度和蛋白水平降低,而SN中TH阳性神经元的数目无明显差异。然而,虽然铁沉积首先出现在OB脑组织中,但OB中TH蛋白水平在1-4周无显著差异。结果提示,腹腔注射FeDx后引起黑质纹状体系统轻度损伤。7.腹腔注射FeDx后,小鼠静态步态指标发生了变化,最大接触面积、最大接触平均强度、步长、步宽和脚印面积等指标在不同的脚爪上出现了下降。然而,并未观察到任何显著的动态步态指标变化。结果提示,腹腔注射FeDx后不会引起明显的运动障碍。结论小鼠腹腔注射FeDx诱导肝脏和脾脏铁过载,OB、SN、HC和STR铁沉积。血清铁浓度随时间依赖性升高,但脑脊液铁浓度无明显升高。CTSB、CTSD、GCase和LIMP-2蛋白在肝脏和脾脏中显著上调,但在脑区无显著差异。急性铁过载OB和原代培养的腹侧中脑星形胶质细胞中CTSB表达上调。腹腔注射FeDxLY2157299抑制剂小鼠SN中多巴胺能神经元的数量保持不变,未引起明显的运动障碍。结果提示,腹腔注射FeDx诱导肝脏和脾脏铁过载以及溶酶体功能障碍,脑区(OB、SN、HC和STR)铁沉积,但不足以引起明显的溶酶体功能障碍和运动障碍。

目的 观察经胸超声心动图诊断机械瓣膜功能障碍的价值。方法 回顾性分析60例接受二次手术治疗的机械瓣膜功能障碍患者，观察本次术前经胸超声心动图、手术、术后病理及随访资料，分析超声的诊断及评估效能。结果 超声心动图检查共于60例患者中检出67枚机械瓣膜功能障碍，包括二尖瓣23枚、主动脉瓣43枚及三尖瓣1枚；主要表现为瓣周漏、瓣膜狭窄及关闭不全、血栓、瓣环脱位、感染性心内膜炎(IE)及窦部夹层等。手术及病理结果显示，60例67枚机械瓣膜功能障碍分布与超声检查所见一致，表现为AY-22989瓣周漏16枚、瓣周纤维组织增生50枚、血栓19枚、瓣环脱位5枚、IE 12枚、退行性变6SCH772984说明书枚。随访期间59例未见明显人工瓣膜bioactive components功能障碍；1例于二次术后第9年出现瓣周漏，经手术封堵后情况良好。结论 经胸超声心动图对于诊断机械瓣膜功能障碍具有一定价值，有助于判断是否需要进行再次手术治疗。

为研究白三叶类黄酮合成途径的关键基因TrCHI在白三叶(Trifolium repens)花色形成中的作用，以白三叶野生型和红花突变体为材料，通过同源克隆得到TrCHI基因并进行转录分析和CHI酶活性测定。结果表明，白三叶购买ZD1839野生型TrCHI基因开放阅读框长660 bp，编码219个氨基酸，其红花突变体TrCHI开放阅读框长度为669 bp，编码222个氨基酸。7处氨基酸突变包括：第13号位的谷氨酸突变成天冬氨酸，第75号位的谷氨酸突变成谷氨酰胺，第154号位的丝氨酸突变成苏氨酸，第218号位的赖氨酸突变成精氨酸，并在末尾增加了甘氨酸、蛋氨酸和赖氨酸。进化分析发现，CHI基因进化具有物种保守性，Tr CHI属于Ⅱ型CHI。花瓣、根和叶柄中，红花突变体TrCHI转录水平显著高于野生型；但在茎、叶和花梗中，红花突变体TrCHI基因转录水平低于野生型。突变体花瓣中CHI酶活性极显著高于野生型(P <0.001)。推测白三叶突变体的红花表Insect immunity型与TrCHI基因突LXH254变并对白三叶中的类黄酮化合物的合成调控有关。本研究为进一步研究TrCHI在白三叶上的潜在功能提供了一定的价值。

目的:本研究旨在评估COSSH-ACLF Ⅱ s对慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者预后的预测性能及其临床效用,并探究该模型用于指导非生物型人工肝治疗HBV-ACLF时机选择的可行性。方法:本研究对2018年1月至2022年10月期间就诊于南方医科大学珠江医院及中山大学第三附属医院的206例HBV-ACLF患者的临床资料进行回顾性分析,其中暴露组(人工肝治疗)116人,非暴露组(内科综合治疗)90人;将新预后模型COSSH-ACLF Ⅱ s在预测结局指标方面的表现与其它五种通用预后模型(COSSH-ACLF s、Child-Turcotte-Pugh、MELD、MELD-Na、CLIF-CACLF s)进行比较,通过区别度、校准度以及临床效用等三个维度对预后模型性能进行综合评估。采用一致性统计量(Concordance statistics,C-statistics)评价新模型的区分度;采用概率密度函数表示存活患者与死亡患者基于预后评分的概率分布情况,通过比较存活患者与死亡患者两个概率密度曲线间的重叠系数,来衡量生存与死亡事件概率分布的相似性,进一步对模型判别区分性能进行验证。利用Hosmer-Lemeshow拟合优度检验对预测模型的校准度进行评估,并通过事件风险十分位条形图与校准曲线将拟合优度检验的结果可视化。采用临床决策曲线分析法(Decision Curve Analysis,DCA)评估预后模型的临床效用;DCA曲线描述了随着阈概率变化,按照模型预测值进行干预的情况下净获益的变化,通过比较不同模型的DCA曲线,进而评价不同模型的临床效用。通过COSSH-ACLF Ⅱ s评分模型的危险分层标准,分别将暴露组与非暴露组病人分为三个亚组:①<7.4;②7.4-8.4;③≥8.4。采用Kaplan-Meier法评估各亚组间患者的28/90天死亡率增长速度并绘制生存曲线;采用对数秩检验(log-rank test),用于比较各亚组间生存曲线;采用COX比例风险模型评估人工肝治疗对各亚组患者预后的影响。结果:1.COSSH-ACLF Ⅱs模型28天死亡率预测的C-statistiAG-221cs(0.926)高于Streptococcal infectionCOSSH-ACLF s 的 C-statistics(0.914,p=0.4280),差异不具有统计学差异,但显著高于 CLIF-CACLF s(0.868,p=0.0005)、MELD-Na(0.822,p=0.0018)、MELD(0.851,p=0.0091)、CTP(0.821,p=0.0010),且差异具有统计学差异;COSSH-ACLF Ⅱs模型90天死亡率预测的C-statistics(0.946)显著高于COSSH-ACLF s(0.920,p=0.0487)、CLIF-CACLF s(0.896,p=0.0002)、MELD-Na(0.845,p=0.0004)、MELD(0.873,p=0.0031)、CTP(0.828,p<0.0001),且差异具有统计学意义。2.预后不良患者的比例随着COSSH-ACLF Ⅱs、COSSH-ACLF s、CLIF-C ACLF s、MELD-Na、MELD、CTP等预后模型评分的增加而逐渐升高,且存活患者与死亡患者概率分布曲线的峰值均有明显差异;新预后模型COSSH-ACLFⅡ s 28/90天存活患者与死亡患者概率分布曲线的重叠系数较其它模型有显著下降(COSSH-ACLF Ⅱ s:30.0%/28.3%;COSSH-ACLF s:31.9%/32.5%;CLIF-C ACLF s:46.3%/41.0%;MELD-Na:46.9%/42.5%;MELD:44.5%/41.3%;CTP:51.7%/50.1%,p 值均<0.05),基于新模型 COSSH-ACLF Ⅱs 定义的存活和死亡患者概率分布曲线的相似性显著低于其它五种评分,COSSH-ACLFⅡs具有更好的预后预测性能。3.COSSH-ACLF Ⅱ s模型90天死亡率的预测值与实际观察值整体相似(-2 Log likelihood=118.379;Hosmer-Lemeshow χ2=8.008,p=0.433),模型拟合度最好,短期预后的预测能力显著优于COSSH-ACLF s(-2 Log likelihood=144.926;Hosmer-Lemeshow χ2=13.271,p=0.103)、CLIF-C ACLF s(-2 Log likelihood=158.150;Hosmer-Lemeshow χ2=1 1.084,p=0.197)、MELD-Na(-2 Log likelihood=195.998;Hosmer-Lemeshow χ2=14.202,p=0.077)、MELD(-2 Log likelihood=181.682;Hosmer-Lemeshow χ2=16.126,p=0.041)。4.临床决策曲线分析结果显示,在相当大的阈概率范围内,采用COSSH-ACLF Ⅱ s模型指导临床决策可取得最高的净获益率,临床应用价值优于COSSH-ACLF s、MELD、MELD-Na、CLIF-C ACLF s 以及 CTP 等模型。5.生存分析结果显示,在分别接受人工肝治疗与内科治疗后,暴露组与非暴露组的第28/90天生存曲线均有差异,且差异有统计学意义,暴露组平均存活时间较非暴露组显著延长(Log-rank χ2=10.425/5.446,p=0.0012/p=0.020);单因素COX比例风险模型分析显示,人工肝治疗是患者的预后相关因素(HR:0.582;95%CI:0.366-0.926;p=0.022),进一步的多因素 COX 回归分析显示,在调整了年龄、性别、HE等级、病情轻重程度以及总胆红素等指标后,人工肝治疗仍是主要的预后相关因素(HR:0.393;95%CI:0.226-0.684;p=0.001)。6.基于COSSH-ACLF Ⅱs模型危险分层标准,将两组病人分为低风险(COSSH-ACLF Ⅱ s<7.4)、中风险(7.4≤COSSH-ACLFⅡs<8.4)、高风险(COSSH-ACLF Ⅱ s≥8.4)。在低风险区间(<7.4),暴露组与非暴露组的28/90天病死率无显著差异(5.1%/6.8%vs 2.1%/2.1%,Pearson Chi-Square 检验χ2=0.630/1.260,p=0.427/0.262);同时,在低风险区间,两组间的生存曲线也无显著差异(Log-rank 检验 χ2=0.598/1.205,p=0.439/0.272),多因素 COX 比例风险模型分析显示,在低风险区间,人工肝治疗不是患者的预后相关因素(HR:0.606;95%CI:0.238-1.358;p=0.723)。在中风险区间(7.4-8.4),暴露组28/90天死亡率较非暴露组均有所下降,差异均有统计学意义(16.2%/32.4%vs 79.2%/79.2%,Pearson Chi-Square 检验 χ2=23.851/12.721,p 均<0.001);同时,在中风险区间,两组间的生存曲线也有显著差异,暴露组平均存活时间较非暴露组有显著延长(Log-rank检验χ2=27.303/20.135,p均<0.001);多因素COX比例风险模型分析显示,在中风险区间,人工肝治疗是影响患者预后的独立因素,接受人工肝治疗的患者死亡风险仅为接受内科治疗患者的0.211倍(HR:0.211;95%CI:0.099-0.448;3-Methyladenine作用p<0.001)。在高风险区间(≥8.4),暴露组与非暴露组的28/90 天死亡率无显著差异(75.0%/90.0%vs 84.2%/94.7%,Pearson Chi-Square检验χ2=0.507/0.308,p=0.476/0.579);在高风险区间,两组间的生存曲线也无显著差异(Log-rank 检验 χ2=1.274/1.652,p=0.259/0.199),进一步的COX比例风险模型分析显示,在高风险区间,人工肝治疗并非是患者的预后相关因素(HR:0.437;95%CI:0.177-1.079;p=0.073)。结论:1.COSSH-ACLF Ⅱs模型的整体预测性能及临床应用价值均显著优于COSSH-ACLF s、MELD、MELD-Na、CLIF-CACLF s、Child-Turcotte-Pugh评分等预后模型;2.COSSH-ACLF Ⅱs模型能有效指导人工肝治疗HBV-ACLF时机的选择。

近年来,随着人们生活水平的逐步提高,糖尿病患病率也逐年攀升,其已成为人类最常见的慢性非传染性疾病之一。尽管盐酸二甲双胍等药物能够有效地降低部分II型糖尿病(T2DM)患者血糖水平,但长期服用后,可能会引起肝损伤以及胃肠道不良反应,因此,在安全有效的天然活性物质基础上开发副作用低,且对T2DM高血糖症状具有多个作用途径的植物降糖剂成为本领域的研究热点。本研究从白背三七植物中提取出一种粗多糖,对其进行分离纯化、化学组成分析及结构表征,揭示其初级结构;通过体外实验研究白背三七多糖化学抗氧化活性以及利用细胞模型探究其体外降血糖活性,并通过动物实验进一步研究白背三七多糖的体内降血糖活性;通过分析肠道菌群微生态变化等进行系统的关联性研究,揭示其血糖调节作用的机制,为白背三七多糖相关的功能性食品和药物的开发提供理论依据。主要研究结果归纳如下:1、研究表明传统的热水提取法提取的白背三七多糖(GDP)得率仅为6.85%,因此采用超声辅助提取法对GDP进行提取。通过单因素试验、Box-Behnken试验以及响应面优化等数理统计方法,确定了白背三七多糖提取优化工艺为:超声功率270 W、提取温度60℃、提取时间37 min。在此条件下,GDP提取率为9.18%,比热水提取法的提取率(6.85%)提高了34.01%。使用纤维素DE-52和葡聚糖G-100层析柱对GDP进行分离纯化,得到中性多糖组分GDP0和酸性多糖组分GDP3、GDP5,得率分别为18.8%、41.1%和6.9%。2、化学组成分析显示GDP和GDP3总糖含量较高,均在SB20358060%以上,各组分几乎不含有蛋白质和多酚,各组分中GDP的糖醛酸含量和硫酸根含量最高,纯化组分中,GDP3含有更高的糖醛酸,GDP5含有更高的硫酸根。GDP、GDP0、GDP3和GDP5的主要分子量(Mw)分别为1634.7 k Da、1.7 k Da、651.2 k Da和1521.6 k Da。单糖组成及NMR分析显示,GDP0主要的链接方式可能是→3)-β-Glcp-(1→,→4,6)-α-Glcp-(1→,α-Galp-(1→,→2,4)-α-Rhap-(1→,→2,3)-α-Fucp-(1→;GDP3的主要链接方式可能是6)-β-Galp-(1→。各组分的紫外吸收光谱显示,在260 nm、280 nm及>400 nm处几乎没有明显的吸收峰,说明GDP、GDP0、GDP3和GDP5的蛋白质、核酸和色素含量低。红外光谱分析显示GDP各组分含有α和β型糖苷键。X射线衍射分析结果显示白背三七多糖各组分倾向于半晶体状态。刚果红实验结果表明GDP、GDP3和GDP5具有三螺旋结构。DSC和TGA分析表明白背三七多糖各组分均具有较好的热稳定性。流变学实验显示,GDP及各组分有较好的流变特性。GDP还具有优异的乳化特性,能够在添加量为2%时稳定油相比为70%的乳液,且乳液稳定性良好。3、体外化学抗氧化实验表明,各组分具有良好的清除DPPH、羟基自由基和ABTS的能力及还原力,总体表现GDP活性最好,清除DPPH、羟基自由基和ABTS的IC_(50)值分别是0.107 mg/m L、0.252 mg/m L和0.589 mg/m L,明显优于其他组分(P<0.05)。GDP及各纯化组分对H_2O_2诱导的氧化应激巨噬细胞RAW 264.7有较好的保护作用,能够显著降低氧化应激细胞中ROS水平、提高SOD酶和CAT酶活力、降低MDA含量。在100μg/m L的实验浓度下,细胞抗氧化能力均表现为GDP>GDP3>GDP5>GDP0。抗氧化作用机制研究表明,GDP和GDP3能够显著提高SOD1、CAT m RNA的表达水平,还能通过上调细胞中Nrf-2和HO-1的m RNA表达影响Nrf-2信号通路。因此,通过上调抗氧化酶及Nrf-2信号通路中相关基因的表达可能是GDP重要的抗氧化作用机制。4、体外降血糖活性测试结果显示GDP、GDP3和GDP5均能有效抑制α-葡萄糖苷酶,且抑制动力学和荧光实验显示三个组分对酶的抑制均为混合型抑制,能够通过改变酶的三级结构达到抑制酶活的效果。细胞实验证明GDP、GDP3和GDP5可以提高胰岛素抵抗(IR)-Hep G2细胞的葡萄糖吸收能力,提升细胞内肝糖原含量以及丙酮酸激酶(PK)与己糖激酶(HK)的活性。通过检测多糖对IR-Hep G2细胞血糖调节相关基因的表达,发现GDP各组分能够通过上调PI3K、GLUT4和AMPK,下调G6pase和PEPCK m RNA的表达,降低细胞胰岛素抵抗,改善细胞葡萄糖利用度。5、动物实验表明,连续灌胃4周的800 mg kg~(-1) BW的剂量(高剂量)的白背三七多糖GDP,能够明显改善链脲佐菌素(STZ)诱导的T2DM小鼠的高血糖症状。具体表现为:高剂量GDP能够显著提升T2DM小鼠的体重,显著降低空腹血糖、口服葡萄糖耐量和糖化血清蛋白含量。有效恢复血清胰岛素水平,改善胰腺组织病变,恢复胰岛细胞数量和形态,显著提升血清中溶血素水平,有效降低血清和肝脏中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)及低密度脂蛋白(LDL-C)水平,恢复高密度脂蛋白(HDL-C)水平,有效降低血清中IL-6和TNF-α细胞因子含量,提高肝脏中糖原含量、SOD酶、谷胱甘肽过氧化物酶和CAT酶的活力,明显降低肝脏中MDA含量以及脏器指数。显著上调T2DM小鼠肝脏中GLUT4、Ins R、IRS2和GS的基因相对表达量,下调G6Pase、PEPCK以及GSK-3β的基因相对表达水平。推测GDP是通过影响PI3K/Akt通路中相关基因表达,来降低小鼠胰岛素抵抗,实现对小鼠血糖的调节和稳定。6、小鼠肠道菌群结构分析结果显示,在门水平上,相比于正常组,模型组高血糖小鼠Safe biomedical applications肠道中厚壁菌门显著增加,而拟杆菌门显著下降。经GDP介入后,糖尿病小鼠的肠道微生物中厚壁菌门(Firmicutes)与拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度比值F:B明显下降。在属层面上,经过不同剂量GDP干预后,norank＿f＿＿Muribaculaceae、Alistipes、Prevotellaceae＿UCG-001和Bifidobacterium等显著升高,unclassified＿f＿＿Lachnospiraceae等丰度显著降低,GDP的治疗组中Muribaculum、Bifidobacteriaceae、Deferribacteres是显著差异物种,可能在调节菌群恢复和维持肠道微生态环境中发挥重要的作用。关联短链脂肪酸(SCFAs)环境因子分析发现,Turicibacter、Prevotellaceae＿UCG-001、Bifidobacterium等与肠道乙酸、丁酸和戊酸等短链脂肪酸成呈正相关。关联糖化血清蛋白和胰岛素环境因子分析发现,Monoglobus、g＿＿uGSK J4分子式nclassified＿f＿＿Oscillospiraceae等呈现正相关,Lactobacillus、Bacteroides、Prevotellaceae＿UCG-001等呈现负相关。关联血清相关生化指标环境因子分析发现,Bacteroides、Helicobacter与HDL-C呈现正相关,与TG、TC、LDL-C呈现负相关;Monoglobus、g＿＿unclassified＿f＿＿Oscillospiraceae与TG、TC、LDL-C呈现正相关,HDL-C呈现负相关。关联血清内炎症因子环境因子分析发现,Weissella、Monoglobus、Odoribacter等呈现正相关,Dubosiella、Bacteroides等呈现负相关。预测功能关联分析发现,GDP有显著提升细胞运动、信号转导机制、转录和碳水化合物运输和代谢,以上功能与机体血糖调节密切相关,揭示了白背三七多糖通过调控肠道菌群对T2DM小鼠血糖调节的可能作用机制。

蓝莓Vaccinium spp.的生长代谢极大程度受到金属离子平衡的影响，ZIP转运蛋白家族在调节植物体金属稳态中起着关键性作用，但目前有关蓝莓ZIP转运蛋白的相关研究较少。为探究蓝莓ZIP转运蛋白基因对铁(Fe)、锌(Zn)、镉(Cd)等金属离子的吸收转运机制，以北高丛蓝莓布里吉塔为研究材料，对蓝莓ZIP基因家族成员进行克隆，采用生物信息学方法分析得到候选基因的核苷酸序列、氨基酸序列、跨膜结构域，对比其他植物的ZIP家族基因，构建系统进化树并筛选得到高相似性的重点研究对象；通过添加金属水培蓝莓的VcZIPs基因表达量分析，探究蓝莓中ZIP转运子的生物学功能；通过转基因酵母金属耐性分析试验，验证VcZIPs异源表达时的功能。结果表明：克隆得到8个VcZIPs全长cDNA序列，其folding intermediate中筛选出3个转运子VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9具有ZIP家族的典型二级结构，或为潜在的ZIP家族成员。q-RT-PCR结果表明，蓝莓叶部ZIP转运子的基因转录水平普遍受到过量金属离子的抑制；蓝莓根部的VcZIPs基因表达普遍受根际过量金属离子诱导，VcZIP4基因的表达量在缺Fe、过量Fe以及超量Cd处理组中分别上调为对照(CK)的5.3、86.5、和45.4倍，VcZIP7基因的表达量在过量Fe处理组中上调AZD9291小鼠为对照的27.2倍，VcZIP 9基因的表达量在过量Cd、超量Cd条VP-16 molecular weight件下响应最显著，分别上调为对照(CK)的142.8倍和360.2倍。转基因酵母金属耐性分析试验表明，VcZIP7可能具有镉转运的功能；VcZIP4、VcZIP9均能介导锰的转运而VcZIP7不具备转运锰的能力；VcZIP4、VcZIP7、VcZIP9均具有铁转运功能，其中VcZIP7的铁转运功能最高，其相对较低的表达可能是蓝莓铁营养低效的重要原因。研究结果可为揭示蓝莓ZIP金属转运子家族的运输机制奠定基础。