RAF信号通路

目的 探讨红豆杉能否通过PI3K/Akt信号通路改善糖尿病肾病大鼠的肾功能，减轻肾部纤维化。方法 100只SD大鼠中随机选取20只作为对照组(行腹腔手术但不摘除右肾，注射60 mg/kg体重生理盐水);剩余80只SD大鼠MG132价格建立糖尿病肾病模型，造模成功后随机分为模型组、厄贝沙坦组、红豆杉组、红豆杉+LY294002组，各20只。检测各组大鼠血液和尿液样本各项指标；蛋白印迹法(Western-Blot)检测肾脏炎症损伤及PI3K/Akt信号通路相关蛋白；取各组大鼠肾脏组织，计算脏器指数；苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠肾脏病理学改变情Immunity booster况；Masson染色观察大鼠肾脏胶原纤维情况。结果 与对照组比较，模型组大鼠空腹血糖(FPG)、24 h尿蛋白(24 hUTP)、胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平及血管selleck HPLC细胞黏附分子-1(VCAM-1)、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)蛋白表达水平、脏器指数明显升高，空腹胰岛素(INS)水平降低(P<0.05);与模型组比较，厄贝沙坦组、红豆杉组、红豆杉+LY294002组FPG、24 hUTP、TC、TG、LDL、Scr、BUN水平及VCAM-1和PAI-1蛋白表达水平、脏器指数明显降低，INS水平升高(P<0.05),其中红豆杉+LY294002组改变最为明显(P<0.05)。染色结果显示，与模型组比较，厄贝沙坦组、红豆杉组、红豆杉+LY294002组大鼠的肾间质和肾小管病理改善明显，肾小体肿胀减轻明显，大鼠的肾小球和肾小管间质中蓝色胶原纤维明显减少，其中红豆杉+LY294002组大鼠肾间质和肾小管病理改变、肾小体肿胀、肾脏纤维化改善情况最明显。与对照组比较，模型组大鼠肾组织中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的比值明显升高(P<0.05);与模型组比较，厄贝沙坦组、红豆杉组、红豆杉+LY294002组大鼠肾组织中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的比值明显降低(P<0.05),其中红豆杉+LY294002组最明显(P<0.05)。结论 红豆杉可能通过抑制PI3K/Akt信号通路改善糖尿病肾病大鼠的肾功能，降低炎症反应，减轻肾部纤维化。

目的:探讨β-谷甾醇抑制耐阿霉素人类髓性白血病细胞K562/ADR增殖、促进细胞凋亡与分化的效果及其可能机制。方法:使用细胞毒性试验计算β-谷甾醇对K562/ADR细胞的半数抑制率(IC_(50)),采用CCK-8法检测细胞增殖率，采用流式细胞术检测细胞凋亡率与线粒体膜电位下降率，使用分光光度法检测细胞上清中SOD活力与MDA含量，使用荧光试剂盒检测细胞ROS强度，使用联苯胺染色检测红细胞分化程度，使用蛋白质印迹(Western blot)检测珠蛋白转录因子1(GATA-1)、β-珠蛋白(β-globin)和核因子e2相关因子2(NF-E2)蛋白表达水平。结果:β-谷甾醇对K562/ADR细胞的半数抑制浓度的IC_(50)为163.64μmol/L。与空白组相比，3个浓度的β-谷甾醇均能抑制细胞增殖、VX-661促进细胞凋亡与红细胞分化，降低SOD活力、线粒体chronic viral hepatitis膜电位，增加MDA与ROS含量，升高GATA-1、β-globin和NF-E2蛋白表达水平(P<0.01)。结论Colforsin使用方法:β-谷甾醇能抑制K562/ADR细胞增殖，促进细胞凋亡，并且诱导红细胞分化，其机制可能是通过促进ROS积累引起氧化应激失衡。

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus,ASFV)引起的高传染性病毒性疾病。自2018年我国出现首例ASF以来,其在大陆各省份迅速蔓延。研究表明ASFV感染后的临床症状类型广泛,极易诱发急性出血热,使得患病家猪和野猪可在短时间内从亚临床病症发展至死亡。然而,至今仍未研发出有效治疗预防该病的药物或疫苗,且随着病毒不断地传播与演化,疫病的流行病学状况愈发恶劣,严重影响了我国生猪养殖业的发展。临床上患病猪呈现出不同程度的病征,这与ASFV的致病能力同易感动物免疫系统间的关系密不可分。然而,目前对涉及此部分的相关免疫逃逸机制知识仍然匮乏。I型干扰素(Type I interferon,IFN-I)是病毒感染早期阶段中机体产生的能够快速有效抗病毒的细胞因子之一,而ASFV作为一种具有高度复杂结构的大型双链DNA病毒,拥有着庞大的基因组,这为其进化出更多拮抗IFN-I产生并消除其影响的逃逸通道提供了先天条件。构成ASFV内核芯壳重要组分的pS273R蛋白,是由S273R基因编码的一种半胱氨酸蛋白酶,能切割内核芯壳蛋白前体生成成熟的内核芯壳蛋白,从而参与病毒粒子的组装,在病毒增殖过程中扮演重要角色。截至目前其在宿主免疫反应中的调节作用尚未完全解析。因此,本论文对ASFV pS273R在调控IFN-I信号通路中的作用及作用机制展开了深入研究。1.ASFV pS273R拮抗IFN-I产生的机制首先利用双荧光素酶报告系统发现pS273R蛋白酶在猪源PK-15细胞中对双链DNA模拟物polselleck化学y(d A:d T)诱导IFN-β的荧光活性具有抑制作用,且呈剂量依赖性,推测pS273R可能靶向切割IFN-I通路的关键效应分子。为了筛选可能的作用靶点,将ASFV pS273R与本实验室构建的8个猪源信号分子真核表达质粒分association studies in genetics别共转染至HEK-293T细胞,蛋白免疫印迹(Western blot,WB)实验结果显示,pS273R蛋白酶呈剂量依赖性地切割DNA模式识别受体DEx H-box解旋酶9(DHX9,DEx H-box helicase 9)蛋白,且直接依赖于其蛋白酶活性。DHX9蛋白在宿主的先天免疫系统中发挥多种功能,本质上属于DEx H-box类RNA解旋酶,有研究报道DHX9具备识别双链DNA的能力,其结构域包括有位于N端的解旋酶核心域(helicase)、C端重复的精氨酸-甘氨酸-甘氨酸域(RGG-Domain)等。本研究通过构建一系列多点突变和截短突变的DHX9真核表达质粒,进一步证实pS273R蛋白酶可多点切割DHX9蛋白,作用区域是位于DHX9蛋白C末端的RGG-Domain,最后通过双荧光素酶实验表明,与全长DHX9蛋白相比,被切割后的产物能够抑制IFN-β的产生,上述研究结果揭示了ASFV pS273R蛋白酶可以作用于DHX9并阻断其介导产生IFN-I的信号通路。2.ASFV pS273R拮抗IFN-I信号转导的机制在证实ASFV pS273R抑制IFN-I产生的基础上,为进一步探究其是否可拮抗IFN-I激活ISGs的产生从而干扰宿主抗病毒状态的建立。通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-q PCR)进一步验证,结果显示pS273R蛋白酶可以剂量依赖性降低IFN-α激活干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes,ISGs)的m RNA转录水平,相较于野生型pS273R,丧失了蛋白酶活性的pS273RC232A蛋白对IFN-α激活的抑制效果有所减弱,表明pS273R的蛋白酶活性参与其拮抗IFN-I信号转导。在深入探究其作用机制的过程中,通过Western blot筛选靶蛋白,结果发现pS273R对TYK2蛋白具有特异性切割作用并依赖其蛋白酶活性,此外pS273R还可降解STAT2蛋白,WB试验的灰度分析结果表明,pS273R的蛋白酶活性同样参与调控对STAT2的降解作用。在鉴定TYK2切割位点的试验中,证实pS273R可识别两处连续的P1位点,分别是610与611位的甘氨酸(Glycine,G)残基,且均位于TYK2的假激酶结构域中。与全长TYK2相比,TYK2被切割后的N端产物TYK2-(1-610aa)诱导ISRE启动子活性的能力明显selleck抑制剂减弱,然而C端产物TYK2-(612-1185aa)无明显变化,提示TYK2并非效应靶点。综合以上试验结果表明,ASFV pS273R蛋白酶可通过下调STAT2的表达来负调控IFN-I信号转导通路。综上我们的研究结果表明,ASFV pS273R蛋白酶通过靶向DHX9的RGGDomain进行多点切割,抑制I型IFN的产生;同时,pS273R还能通过降解STAT2蛋白来抑制IFN-I的信号转导;此外,pS273R的蛋白酶活性对抑制IFN-I的产生及信号转导至关重要,揭示了ASFV免疫抑制的一种新策略。

系统性红斑狼疮（systemic lupProtein Tyrosine Kinase抑制剂us erythematosus, SLE）是一种慢性、全身多系统受累的自身免疫性疾病，其病因和发病机制尚未完全明确。作为适应性免疫应答的主要组成部分，B细胞在自身免疫性疾病中起到了关键作用。已有研究表明，自身反应性B细胞过度增殖、活化，从而产生多种自身抗体是SLE发病至关重要的环节，也是造成全身多脏器损害的病理基础[1]。靶向B细胞治疗可抑制B细胞的活化、增殖，减少自身抗体的产生，因此B细胞在近些年成为了SLE治疗的新型靶点。国内外亦进行了多项临床研究证实了B细胞靶向治疗药物的有效性及安GNE-140作用全性，如贝利尤单抗、利妥昔单抗、泰它西普等，为SBiomedical ResearchLE治疗的进展提供了更多证据。本综述主要围绕靶向B细胞治疗的进展进行讨论，包括靶向B细胞表面抗原、靶向B细胞因子、共刺激阻断、酪氨酸蛋白激酶抑制剂等。

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）作为一种自身免疫性疾病，主要以持续性滑膜炎症为其主要特征，常对称性的累及多个关节，严重时可导致关节畸形、关节功能丧失甚至残疾。RA发病机制复杂，防治复杂，彻底治愈困难。既往研究证实，控制炎症过程的核因子-κB（NF-κB）信号通路、调节氧化应激、抑制炎症、维护细胞稳态的核因子E2相关因2（Nrf2）/血红素氧合酶-1（HO-1）信号通路、在细胞生长、此网站分化、凋亡以及炎症反应中发挥关键作用的Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路、抗炎、抗氧化、调控滑膜细胞的沉默信息调节因子1（SIRT1）信号通路、抗炎、调控能量代谢的腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路、与RA中的血管生成相关的缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）/血管内皮生长因子（VEGF）信号通路、与线粒体自噬相关的PTEN诱导假定激酶1（PINK1）/帕金蛋白（Parkin）信号通路均是防治RA的重equine parvovirus-hepatitis要靶点与机制。同时，众多研究证实，中医药通过调控上述信号通路，发挥上述信号通路的相关作用来防治RA，并展现了中医药调控途径多、长效、不良反应少等优势。兹本文通过查阅众多研究报道，阐述了LGK-974使用方法上述信号通路在RA中的作用，并详细总结了以近年来中药干预上述信号通路防治RA的最新研究成果，旨在推动对RA发病机制和中药治疗的深入研究，为中药的合理应用提供科学依据，更是为未来治疗RA的新药物研发和临床实践提供有益的启示。

目的 分析槲皮素对脑小血管病(CSVD)大鼠认知功能能力以及神经细胞凋亡的影响,以及相关的作用机制。方法 40只CSVD模型大鼠随机分为模型组(Model)、低剂量(LD,25mg·kg~(-1)槲皮素)、中剂量(MD,50mg·kg~(-1)槲皮素)和高剂量(HD,100mg·kg~(-1)槲皮素)组,每组10只。取大鼠海马组织,行苏木精-伊红染色,TUNEL染色和Nissl染色,分别采用IHC和RT-qPCR海马组织中Bcl2关联X蛋白(BCL2associated X,Bax)、B淋巴细胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、胱天蛋白酶-3 (Caspase-3)和脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白和基因进行检测;采用WB检测海马组织中BDNF、磷酸化-酪氨酸激酶受体B (p-TrkB)、酪氨酸激酶受体MRTX849B (TrkB)、磷酸化-磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、磷酸化-蛋白激酶B(p-AKT)和蛋白激酶B(AKT)蛋白;RT-qPCR法对海马组织中TrkB、PI3K和AKT基因表达。结果 与Normal组比较,Model组海马组织神经细胞凋亡率明显升高(P<0.001);与Model组比较,槲皮素干预各组(LD,MD和HD)海马组织神经细胞凋亡率明显降低(P<0.05),海马组织中Bax、Caspase-3表达水平显著降低,Bcl-2、BDNF、p-TrkB/TrkB、p-PI3KCanagliflozin体内/PI3K、p-AKT/AKT水平显著升高(P<0.05),其中HD组效果最为明显。结论 槲皮素可通过激活BDNF/TrkB及下游的PI3K/AKT信号通路改善CSVD大鼠认知功能障碍和降低海马组织神经细胞凋programmed death 1亡。

本试验以经典的大肠杆菌LPS刺激的肉仔鸡免疫应激模型为研究对象,通过体内饲养试验和体外淋巴细胞培养试验相结合的方法,就黑沙蒿黄酮(Artemisia ordosica flavonoids,AOF)对免疫应激的缓解作用及可能的机制展开了系统研究。试验一:黑沙蒿粗黄酮对肉仔鸡生长性能和免疫、抗氧化功能的影响试验采用单因素随机设计,选取240只1日龄爱拔益加(AA)雄性肉仔鸡,按照体重相近原则随机分5个处理组,每个处理6个重复,每个重复8只鸡。对照组肉仔鸡饲喂基础日粮,试验组日粮则在基础日粮中分别添加250、500、750和1000mg/kg的黑沙蒿粗黄酮(AOCF),试验为期42 d,分为前期1-21 d和后期22-42 d。结果表明:日粮添加不同剂量的AOCF可以提高肉仔鸡ADG,降低F/G,促进机体生长发育;上调血清Ig G和细胞因子(IL-2、IL-4及IL-6)的水平,增进机体免疫能力;增加血清CAT、GPx、T-SOD的活性及TAC,降低MDA的含量,增强机体抗氧化功能。综合上述指标考量,当添加剂量为750 mg/kg时,AOCF对肉仔鸡生长、免疫和抗氧化性能的促进效果较为理想。试验二:黑沙蒿粗黄酮对LPS诱导的肉仔鸡免疫应激的缓解作用及机理研究综合试验一中生长性能、免疫和抗氧化相关指标的结果,选择750 mg/kg的AOCF作为肉仔鸡日粮中的最适添加剂量,随后在本试验中根据该添加剂量设置低(500 mg/kg)、中(750 mg/kg)、高(1000 mg/kg)3个AOCF添加水平。选取240只健康且体重相近(38.14±0.36 g)的1日龄雄性AA肉仔鸡,采用完全随机试验设计,分为5个处理组,每组6个重复,每个重复8只鸡,分组如下:(1)对照组,饲喂基础日粮并腹腔注射生理盐水;(2)LPS组,饲喂基础日粮并腹腔注射LPS溶液;(3)AOCF低剂量组,在基础日粮中添加500 mg/kg的AOCF并腹腔注射LPS溶液;(4)AOCF中剂量组,在基础日粮中添加750 mg/kg的AOCF并腹腔注射LPS溶液;(5)AOCF高剂量组,在基础日粮添加1000 mg/kg的AOCF并腹腔注射LPS溶液。试验期为42 d,分为预饲期(第0-15 d)、应激期(第16-28 d)、恢复期(第29-42d)。分别在试验第16、18、20、22、24、26、28 d给各处理组肉仔鸡腹腔注射7.5m L/kg体重的生理盐水或等量的LPS溶液(LPS溶液浓度为100μg/m L生理盐水)。结果表明:(1)日粮添加AOCF缓解了LPS诱导的免疫应激肉仔Elexacaftor鸡脾脏指数的升高和法氏囊指数的降低,并通过下调TLR4、My D88、TRAF6、NF-κB p65、NF-κB p50、IL-1β、IL-6基因和NF-κB p65、IL-1β蛋白的过表达及NF-κB p65的磷酸化水平,上调PPARγ的m RNA和IκBα的基因及蛋白表达,降低IκBα的磷酸化,减少IL-1β和IL-6的过度产生,抑制机体的炎症反应,从而缓解LPS引起的免疫应激;(2)日粮添加AOCF可以抑制由LPS导致的Keap1基因和蛋白的过表达,增加Nrf2和SOD的基因及蛋白表达,上调CAT、GPx的m RNA和HO-1的蛋白表达水平,从而提高抗氧化酶的活性和TAC,并减少ROS和氧化副产物(MDA、8-OHd G、PC)的过度生成,改善机体的氧化损伤,从而缓解LPS引起的免疫应激;(3)AOCF可以通过缓解LPS刺激下免疫应激肉仔鸡血清应激相关激素ACTH、CORT升高和生长相关激素IGF-1降低,改善机体的免疫和抗氧化能力,提高免疫应激肉仔鸡CP和EE的表观代谢率来缓解LPS导致的生长性能下降,增加免疫应激状态下肉仔鸡的BW、ADG和ADFI。试验三:黑沙蒿黄酮的分离纯化及其对LPS刺激的肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫和抗氧化功能的影响(1)通过AB-8大孔树脂并聚酰胺柱层析对AOCF中的黄酮类化合物进行分离纯化,得到纯度更高的黑沙蒿黄酮(由55.61%提高至73.59%),采用肉仔鸡外周血淋巴细胞(Peripheral blood lymphocytes,PBLs)建立体外培养模型,探究黑沙蒿黄酮(AOF)对LPS诱导的免疫应激肉仔鸡PBLs免疫和抗氧化功能的影响,并为后续体外试验筛选出AOF的最适添加水平为100μg/m L。试验采用2×6因子设计,共设12个处理,即主效应包括2个应激状态(添加10μg/m L LPS的应激组和不含LPS的非应激组)和6个AOF添加水平(0、25、50、100、200和400μg/m L),每个处理6个重复孔。结果表明:(1)LPS非应激培养条件下,AOF提高细胞培养液中了IL-2、IL-4、IL-6、Ig A、Ig G和Ig M的含量;LPS应激培养条件下,AOF缓解了细胞培养液中IL-1β、IL-2、IL-6的升高和IL-4、Ig A、Ig M的降低;(2)LPS非应激培养条件下,AOF降低了细胞培养液中ROS、MDA、PC和8-OHd G的水平,提高了CAT、T-SOD、GPx的活性和TAC;LPS应激培养条件下,AOF缓解了细胞培养液中ROS、MDA、PC、8-OHd G水平的升高和T-SOD、GPx、CAT活性及TAC的降低;(3)AOF增强了肉仔鸡PBLs的活力。综合上述指标考量,100μg/m L的AOF对肉仔鸡PBLs活力、免疫和抗氧化性能的作用效果较为理想。试验四:黑沙蒿黄酮通过NF-κB信号途径缓解肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫应激的机理研究本试验在试验三的基础上,以LPS诱导的免疫应激肉仔鸡PBLs为研究对象,通过添加NF-κB信号通路的特异性抑制剂PDTC阻断该通路,进而从NF-κB信号通路研究AOF缓解PBLs免疫应激的作用机制。采用单因素完全随机设计,共设7个处理:CON组、LPS组、AOF组、AOF+PDTC组、LPS+PDTC组、LPS+AOF组、LPS+AOF+PDTC组,每个处理6个重复。结果表明:正常培养条件下,AOF增加了肉仔鸡PBLs中TLR4、NF-κB p65、IκBα的基因表达,上调了IL-1β、IκBα的蛋白表达和NF-κB p65的蛋白表达和磷酸化水平,促进了IL-1β和IL-6的产生,通过适度激活NF-κB信号通路发挥免疫增强作用;LPS刺激条件下,AOF缓解了由LPS导致的TLR4、My D88、NF-κB p65、IL-1β、IL-6基因水平和NF-κB p65蛋白水平和磷酸化水平的过度升高,上调了IκBα的基因表达和蛋白表达androgenetic alopecia并下调了IκBα的磷酸化,降低了IL-1β的基因和蛋白的过表达,抑制了IL-1β、IL-2、IL-6的过度分泌,同时提高了IL-4、Ig A、Ig G、Ig M的含量,通过抑制NF-κB信号通路的过度激活发挥抗炎活性,从而缓解LPS导致的肉仔鸡PBLs的免疫应激。试验五:黑沙蒿黄酮通过Nrf2信号途径缓解肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫应激的机理研究本试验在试验三的基础上,以LPS诱导的免疫应激肉仔鸡PBLs为研究对象,通过添加Nrf2信号通路的特异性抑制剂ML385阻断该通路,进而从Nrf2信号通路研究AOF缓解PBLs免疫Alpelisib应激的作用机制。采用单因素完全随机设计,共设7个处理:CON组、LPS组、AOF组、AOF+ML385组、LPS+ML385组、LPS+AOF组、LPS+AOF组+ML385组,每个处理6个重复。结果表明:AOF可以下调肉仔鸡PBLs中Keap1的基因表达和蛋白表达,上调CAT、GPx的基因表达、HO-1的蛋白表达和Nrf2、SOD的基因表达和蛋白表达,通过激活Nrf2信号通路发挥抗氧化活性,并能够缓解LPS对Nrf2信号通路的抑制作用,从而减轻LPS诱导的肉仔鸡PBLs的免疫应激。综上所述,日粮添加AOCF不仅可以提高常规饲养条件下肉仔鸡的免疫和抗氧化能力,发挥促生长作用,而且可以缓解由LPS诱导的免疫应激肉仔鸡促炎因子含量的升高、ROS及氧化副产物水平的增加、抗氧化酶活性的降低,来改善机体的免疫应激和氧化损伤,这可能与AOF可以抑制NF-κB信号通路的过度活化、激活Nrf2信号通路发挥免疫调节和抗氧化作用有关。

糖尿病是目前世界范围内严重威胁人类健康的慢性疾病之一，常伴有严重的临床并发症，如糖尿病性心肌病、肾病、视网膜病变、神经病变、等。由于西药治疗副作用的存在，从天然植物MLN4924采购中寻找新型分子药物对抗糖尿病及其并发症已成为当前研究的热点。木犀草素是一种天然存在的类黄酮，广泛存在于水果、蔬菜等植物selleck抑制剂中，具有抗炎、抗氧化、调节免疫woodchuck hepatitis virus等多种药理作用。大量研究证实，木犀草素在控制血糖和对抗糖尿病方面具有显著效果。为了更好地了解木犀草素的作用机制，本文对近年来国内外木犀草素防治糖尿病的相关文献进行归纳整理，综述木犀草素在恢复胰岛β细胞功能、改善胰岛素抵抗、调节脂质代谢、抑制肠道糖脂吸收以及抑制氧化应激和炎症等方面的作用机制，并对木犀草素调控糖尿病的研究前景进行展望，以期促进该中药活性物质的开发和利用。

目的 探讨幽门螺旋杆菌(Hp)毒力基因cagA、vacA、iceA表达与慢性萎缩性胃炎(CAG)的关系。方法 选取2018年6月-2021年6月厦门市第五医院收治的CAG患者190例，采用聚合酶链式反应(PCR)检测毒力基因cagA、vacA、iceA表达情况，根据毒力基因表达情寻找更多况分为对照组(无毒力基因表达)18例、A组(一种毒力基因表达)67例、B组(两种毒力基因表达)58例和C组(3种毒力基因表达)47例。比较各组慢性胃炎分级评估系统(OLGA)分级、合并化生、上皮内瘤变和血清胃蛋白酶原Ⅰ(PGⅠ)、胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)、胃泌素(GAS)水平。结果 不同毒力基因表达患者OLGA分级、化生和上皮内瘤变情况比较，差异有统计学意义(P<0.05),且更多A、B、C组OLGA分级Ⅲ～Ⅳ级、合并化生和上皮内瘤变的占比均高于对照组(P<0.05),C组的OLGA分级Ⅲ～Ⅳ级、合并化生和上皮内瘤变的占比高于A、B组(P<0.05),但A和B组比较，差异无统计学意义；各组患者血清PGⅠ、PGⅡ和GAS水平比较，差异有统计学意义(P<0.05);且对照组>A组H pylori infection>B组>C组(P<0.05)。结论 Hp毒力基因cagA、vacA、iceA表达可能与CAG患者病情发生发展及病情严重程度有关，3种基因同时表达更容易加重CAG病情。

近几十年来,抗生素耐药性持续发展,导致多药耐药菌感染对公共健康威胁严重。但在过去三十年中,新抗生素数量不断下降,治疗耐药菌感染的抗菌剂替代品也不断减少。因此,迫切需要开发具有不同机制且不易诱导耐药的抗菌剂替代品。抗菌肽(AMPs)因其独特的膜破坏作用机制而不易诱导细菌耐药性,所以在开发新型抗菌剂方面前景广阔。Meucin-18是从Mesobuthus eupeus蝎子毒液中提取的天然AMP,由18个氨基酸残基组成,序列为FFGHLFKLATKIIPSLFQ,羧基端游离,含有2个赖氨酸,故带有2个净正电荷,二级结构为α-螺旋,具有两亲性。Meucin-18具有抗菌、抗病毒等多种生物活性,有着广阔的应用前景。对Meucin-18的研究较少,基本集中在抗感染活性,其主要通过固相合成来制得,且目前没有关于其合成的研究。固相合成法从开发以来日渐成熟,但是仍旧存在一些缺点,例如合成过程中无法去除副产物、投料量过大等。所以我们考虑将疏水载体辅助液相合成法应用于Meucin-18的合成,建立一条新的合成路线,以适应今后Meucin-18的中试放大。因此,我们主要进行了以下研究:(1)我们将Meucin-18分为3个片段进行分段合成,依次为片段F-Boc(Boc-Phe-Phe-Gly-His(Trt)-Leu-OH)、片段 G-Fmoc(Fmoc-Phe-Lys(Boc)-Leu-Ala-Thr(t-Bu)-Lys(Boc)-OH)和 Tag-片段 H(Ile-Ile-Pro-Ser(t-Bu)-Leu-Phe-Gln(Trt)-O-Tag);(2)探究了载体和氨基酸投料比、温度、有机碱等对不同氨基酸与载体偶联的影响,确定了最佳偶联条件:Fmoc-Gln(Trt)-OH与载体偶联的最佳条件为40℃加热条件下用DCM作为溶剂,向溶剂中依次加入Tag-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、DICselleck化学 和 DMAP,各原料投料比为 Tag-OH:Fmoc-Gln(Trt)-OH:DIC:DMAP=1:1.2:1.5:0.2,Fmoc-Gln(Trt)-OH 与载体偶联的最佳条件适用于 Fmoc-Lys(Boc)-OH与载体的偶联;(3)探究了 TFA用量对片段F-Boc合成中最后一步脱载体反应的影响(减少副产物产生的量),确定当TFA用量为0.7%时,得到的片段F-Boc的收率和纯度均为最高,分别为84.4%和78.3%;(4)探究了不同溶剂和温度对片段G-Fmoc脱载体反应的影响:确定以DCM为溶剂、反应温度为25℃,10%TFE和1%TFA依次加入为最佳反应条件,得到产物的收率和纯度最高,分别为74.2%和88.9%;(5)针对片段G-Fmoc后处理进行了探究,通过加入硅藻土减少抽滤粘度,抽滤更易进行,抽滤时间大大缩短,节约了时间成本,同时,减少了粘附带来的产物损失,对于产率的提高有所帮助;(6)探究了片段与片段偶联条件对Meucin-18的收率和纯度的影响,最终确定 Tag-片段 H:片段 G-Fmoc:HATU:HOAt:DIPEA:DIC=1:1.05:1.05:1.05:5:1,Tag-片段H,G:片段F-Boc:HATU:HOAt:DIPEA:DIC=1:1.05:1.05:1.05:5:1 为最佳偶联条件,此时得到的Meucin-18粗肽的收率和纯度均为最高,分别为70.9%和82.7%。除了对Meucin-18的合成进行研究外,还对其结构与活性进行了探究。我们设计了若干个Meucin-18衍生肽,设计策略包括缩短肽链、改变净正电荷数量、改变肽序列等,接着利用生物信息学预测软件预测了衍生肽的物理结构参数。最终决定合成4个衍生肽(CH-1,CH-2,CH-3,CH-4),并对4个衍生肽的生物活性作了评价。体外抗菌活性研究表明,CH-1对所测试的菌株均表现出优异的抗菌活性,CH-2和CH-3未对所测试的菌株表现出明显抗菌活性,而CH-4仅对所测试的部分菌株有良好的抗菌活性。具体说,CH-1对所测试的6种革兰氏阳性敏感菌株、7种革兰氏阳性耐药菌株、2种革兰氏阴性菌株均表现出优异的抗菌活性。相较于Meucin-18,CH-1对革兰氏阴性菌表现出优异的抗菌活性,其对/E.coli ATCC25922 和P.ATCC27853 的 MIC 值分别为 3.8 和 7.5 μM,均是Meucin-18活性的16倍;CH-1对于革兰氏阳性耐药菌S.pyogenes EMA-R、E.faecalis ATCC51299 和 E.faecium ATCC51559 的 MIC 值分别为 7.5、15.0 和 7.5μM,均为Meucin-18活性的4倍。CH-1对革兰氏阳性耐药菌S.aureus ATCC31007、S.aureus ATCC43300的抗菌活性优异,对应MIC值均为1.9μM。CH-1对S.aureus CI和S.epidermidis的抗菌活性较强,MIC值均为3.8 μM。CH-1对革兰氏阳性敏感菌S.pyogenes EMA-S和E.faecium ATCC19434的抗菌活性是Meucin-18的4倍,CH-1的对应MIC值均为7.5 μM,抗菌活性较好。CH-1对B.pumilus CMCC63202、B.subtilis ATCC9372及S.aureus ATCC25923 的抗菌活性优异,MIC 值都是 1.9 μM。另外,CH-1 对E.faecalis ATCC29212 的 MIC 值为 7.5 μM,抗菌活性较好。CH-1对S.aureus ATCC25923的MBC/MIC值为2,属于杀菌剂。时间杀菌动力学研究表明,CH-1在1×MIC浓度下9h内将S.aureus ATCC25923全部杀死,CH-1在2×MIC浓度下3 h内将S.aureus ATCC25923全部杀死,由此可见CH-1的杀菌能力随着作用时间的延长或浓度的增加而增强,具有时间和浓度依赖性。另外,CH-1对强酸、强碱、高温以及常见生理盐具有较高的耐受性。而且,CH-1即使在4×MIC时溶血率都不足10%,在1×MIC和2×MIC时无明显溶血,与Meucin-18相比,溶血率降低。CH-1对生物膜的抑制能力增强,这可能在一定程度上促进了其抗菌能力的增强。TEM观察到,CH-1能够裂解细菌细胞膜,导致细菌死亡,发挥GSK126分子量杀菌作用。与Meucin-18相比,CH-1将第4位的组氨酸替换为了精氨酸,总体上增加了抗菌肽的一个净正电荷,从而使CH-1对显负电性的细菌膜的静电吸引增加,对生物膜的抑制作用以及对细胞膜的破坏in vitro bioactivity作用增强,导致抗菌活性增强。另外,静电相互作用使CH-1选择性地与带负电的细菌细胞膜结合,增加了 CH-1对细菌细胞膜靶向性和降低了 CH-1的溶血活性等。综上所述,我们探究出了一条用于Meucin-18的新的合成方法和路线,此方法可以实时监测反应进程,减少反应原料的使用和降低成本,提高产品收率和纯度。另外,我们对Meucin-18衍生肽生物活性的系统性研究表明CH-1是一个很有发展前景的候选抗菌剂,值得进一步研究。