RAF信号通路

(S)-2-氨基丁醇同时具有羟基及氨基官能团，是多种重要药物分子的关键手性中间体，生物合成(S)-2-氨基丁醇尚缺少有效的酶元件。以塞格尼氏菌(Segniliparus rugosus)来源的羧酸还原酶SrCAR为研究对象，通过对实验室已有SrCAR突变文库进行筛选测试，结合活性位点共进化分析，同时利用组合活性中心饱和突变策略(Combinatorial active-site saturation test, CAST)构建新的突变体文库，经测试最终获得优势突变体XDehydrogenase抑制剂H7(G430V/E533F/A627N)。该突变体催化底物N-Boc-(S)-2-氨基丁酸到醛产物的活性(k_(cat)/K_Dolutegravirm)较野生型SrCAR提高2.1倍，热熔值(T_m)提升2.3℃。进一步通过引入荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)来源的醇脱氢酶PfADH,可还原N-Boc-(S)-2-氨基丁醛到醇产物。XH7和PfADH的双酶共表达体系反应5 h即可将20 mmol/L底物实现几乎完全转化，转化率达到99%,并经脱Boc保护与分离纯化获得终产物(S)-2-氨基丁醇，得率为60%。通过分子动力学模拟解析最优突变体活性及热稳定性提高的分子机制，为SrCAR酶设计改造提供新的研究思路，拓展酶法合成(S)-2氨基丁醇的生物酶工具箱，可为类似高附加值医药中间体的Immunochromatographic assay生物合成提供理论和实践指导。

氧化应激是疾病和衰老过程中常见的应激状态。外源性抗氧化剂能有效对抗氧化应激和缓解氧化应激相关疾病症状的发生。而抗氧化剂作为营养补充剂一直是食品营养研究关注的热点。食品中含有许多抗氧化的活性成分,其中食源性抗氧化剂来源于植物和动物提取物中的天然活性成分,包括蛋白质、多肽、多糖、酚类和类黄酮等。临床营养研究中,食源性抗氧化剂的补充已被证明可以对某些慢性疾病发挥预防及缓解Infection types症状的生理功能。因此,筛选有效的食源性物质作为抗氧化补充剂至关重要。体外抗氧化性能研究是筛选的第一步,选择合适的方法可以合理评价抗氧化物质的性质。目Adezmapimod小鼠前对于食源性物质抗氧化活性的评价方法缺乏系统性的总结和讨论。本文介绍了各种体外抗氧化性能评价方法的优缺点、适用性及作用机理,同时提供了一套筛IACS-10759分子式选食源性抗氧化补充剂的应用策略。

目的 挖掘呕吐毒素(deoxynivalenol, DON)降解酶,应用双酶体系实现呕吐毒素的高效降解。方法 利用生物信息学技术从国家生3-MA IC50物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)数据库筛选潜在DON降解酶AKR18A2,在大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)中进行重组和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,经镍亲和层析纯化并鉴定AKR18A2的酶学性质,构建德沃斯氏菌(Devosiasp.)来源的DON降解酶QDDH和AKR18A2双酶作用体系,实现DON的高效降解。结果 来自鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)的呕吐毒素降解酶(AKR18A2)由343个氨基酸组成。该酶属于醛酮还原酶超家族,45℃和pH7.0为最适反应条件。AKR18A2可在24h内降解15.42%DON,而双酶(QDDH和AKR18A2)协同作用4h后对DON的降解率Pexidartinib作用可提高至98.02%。结论 本研究鉴定了一种新型DON降解酶AKR18Atethered membranes2,并首次创新建立双酶联用体系进一步实现DON的高效降解。

糖尿病,特别是Ⅱ型糖尿病,影响全球很大一部分的人口,估计有500亿成年人受到影响。糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病中较为常见的微血管并发症,病程进展迅速且具有不可逆性,严重威胁患者生命安全。因此寻找延缓DN进程的药物,为患者争取更多的生存时间,具有重大意义。人参为百草之王,含有人参皂苷、人参多糖(Ginseng Polysaccharides,GPS)、人参多肽和少量的甾类及萜类小分子等化合物。研究报道,GPS具有抗氧化、免疫调节、抗炎等作用。本研究通过纯合子糖尿病小鼠(B6.BKSLeprdb,db/db)模型观察GPS对DN的保护作用,并初步探讨其作用机制。实验目的:观察GPS对db/db小鼠DN的保护作用,并初步探讨其作用机制。实验方法:将12周龄db/db小鼠依据血糖水平并结合体重随机分为模型(Model)组、GPS低剂量组及GPS高剂量组,m/m小鼠为对照(Control)组。Control组和Model组均灌胃(ig)给予蒸馏水,GPS低、高剂量组分别ig给予GPS biorelevant dissolution100、200 mg/kg,1次/天,连续给药8周。每周记录小鼠体重及血糖,末次给药1 h后,取尿液,检测尿液中尿素氮(Urea Nitrogen,BUN)、尿肌酐(Urine Creatinine,UCR)、尿蛋白(Urine Protein,UP)含量;取血液,检测血清中总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein,HDL-c)、低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL-c)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)含量;取肾组织,计算肾脏指数,测定丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量及超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性;苏木精-伊红染色法(Hematoxylin Eosin Staining,HE)检测肾组织病理学改变,过碘酸雪夫染色(Periodic Acid Schiff Stain,PAS)检测肾小球系膜基质及细胞外基质(Extracellular Matrixc,ECM)增生情况,Masson染色检测肾纤维化程度,透射电镜检测肾小球基底膜(Glomerular Basement Membrane,GBM)厚度,免疫组化技术检测肾组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)表达水平,Western Blot检测肾组织中TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表达水平。实验结果:1.体重、血糖及肾脏指数:与Control组比较,Model组小鼠体重和空腹血糖均显著升高(P<0.01),肾脏系数显著降低(P<0.01);与Model组相比,GPS 100、200 mg/kg组的小鼠肾脏指数显著提升(P<0.05),体重和血糖无明显变化,均无统计学意义(P>0.05)。2.UCR、BUN及UP含量:与Control组比较,Model组小鼠尿液中UCR、BUN及UP明显升高(P<0.01);与Model组比较,GPS 200 mg/kg可显著降低小鼠尿液中UCR、BUN、UP含量(P<0.01),GPS 100 mg/kg可显著降低小鼠尿液中UP含量(P<0.05),GPS 100 mg/kg有降低db/db小鼠尿液中UCR、BUN含量的趋势,但无统计学意义(P>0.05)。3.TC、TG、HDL-c、LDL-c含量:与Control组比较,Model组血清中TC、TG、LDL-c含量显著升高(P<0.01),HDL-c含量显著降低(P<0.01);与Model组比较,GPS 200 mg/kg可显著降低小鼠血清中TC含量(P<0.01),提高血清HDL-c含量(P<0.05),GPS 100、200 mg/kg可显著降低小鼠血清中TG(P<0.01)、LDL-c含量(P<0.05),GPS 100 mg/kg有降低小鼠血清中TC含量、升高HDL-c含量的趋势,但无统计学意义(P>0.05)。4.TNF-α、IL-1β及IL-6含量:与Control组比较,Model组小鼠血清中TNF-α、IL-1β及IL-6含量显著升高(P<0.01);与Model组比较,GPS 100、200mg/kg可显著降低血清中TNF-α及IL-6含量(P<0.01),GPS 200 mg/kg可显著降低血清中IL-1β含量(P<0.01),GPS 100 mg/kg有降低血清中IL-1β含量的趋势,但无统计学意义(P>0.05)。5.MDA含量及SOD活性:与Control组相比,Model组MDA含量显著升高(P<0.01),SOD活性显著降低(P<0.01);与Model组相比,GPS 100、200 mg/kg可显著降低MDA含量(P<0.05或P<0.01),显著升高SOD活性(P<0.05或P<0.01)。6.组织病理学观察:6.1 HE染色:Control组小鼠肾小球结构形态正常、清晰,基底膜光滑,肾小球形态规则,肾间质无异常,肾小管排列整齐,无炎性细胞浸润;Model组小鼠肾小球体积增大,基底膜增厚,周围可见炎性细胞浸润,且肾小管结构紊乱,出现扩张现象;GPS 100 mg/kg组小鼠肾脏有所改善;GPS 200 mg/kg组小鼠肾小球体积明显减小,基底膜厚度降低,仅有少量炎性细胞浸润,肾小管排列紧密。6.2 PAS染色:Control组小鼠肾脏结构完整、清晰,GBM光滑,肾小球形态规则,肾小管排列紧密整齐,无炎性细胞浸润,未见肾小囊中糖原沉积;Model组小鼠GBM增厚,ECM积聚,肾小囊内有大量紫红色糖原沉积;GPS100 mg/kg组小鼠GBM增厚、ECM积聚,肾小囊内沉积紫红色糖原减少;GPS200 mg/kg组小鼠肾小球形态正常,肾小管排列规则,GBM厚度基本正常,肾小囊有少量糖原沉积现象。6.3 Masson染色:Control组小鼠肾小管排列正常及肾小球形态正GSK1349572 MW常,未见胶原纤维增生,可见管状基底膜;Model组小鼠肾间质组织中可见大量染色胶原,间质纤维组织呈束状和网状增生;GPS 100 mg/kg组小鼠肾小球体积减小,纤维组织增生症状减轻;GPS 200 mg/kg组小鼠肾小管排列较规则,可见少量胶原纤维增生。6.4透射电镜:Control组小鼠肾组织GBM宽度正常,足突明显且呈现梳子齿状;Model组小鼠足突融合明显呈现线状且排列紊乱,ECM增生及GBM增厚;GPS 100 mg/kg组小鼠GBM厚度变薄,足突融合程度降低,ECM增生程度减轻;GPS 200 mg/kg组小鼠足突排列重现梳子齿状,足突融合现象显著减轻,GBM厚度变薄,ECM增生程度减轻。7.免疫组织化学:Control组小鼠肾小管、肾小球及肾间质均未见α-SMA表达,仅在血管平滑肌细胞少量表达;Model组小鼠α-SMA蛋白除在肾小管平滑肌肌层外,部分肾小管上皮细胞内出现棕黄色颗粒,主要在GBM侧和肾间质细胞胞浆中表达;GPS 100、200 mg/kg组小鼠GBPhospholipase (e.g. 抑制剂M侧和肾间质细胞胞浆中α-SMA蛋白表达减少。8.TGF-β1、Smad2/3蛋白表达:与Control组相比,Model组小鼠肾组织中TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与Model组比较,GPS 100、200 mg/kg组的p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad蛋白表达水平均显著降低(P<0.01),GPS 100、200 mg/kg组的TGF-β1蛋白表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。实验结论:GPS可改善db/db小鼠肾功能,调节血脂代谢,抑制炎症因子释放,提高抗氧化能力,减轻DN的肾损伤,延缓肾纤维化发生发展,其作用机制可能与抑制TGF-β1/Smad2/3信号通路有关。

卵菌种类繁多,目前已知的卵菌超过1 800种,在世界范围内引起多种动植物疾病。STI sexually transmitted infection其中植物病原卵菌可对农业生产及自然生态系统构成严重的威胁。辣椒疫霉(Phytophthora capsici)属于疫霉属植物病原卵菌,是甾醇缺陷型生物,可侵染包括茄科、葫芦科等多种植物,导致根、茎及果实腐烂等多种症状,给农业生产造成巨大损失。笔者课题组前期研究发现,辣椒疫霉自身没有甾醇合成能力,但其基因组中保留了甾醇生物合成通路中的基因PcDHCR7,其在疫霉体内的生物学功能尚不明确。本研究采用CRISPR/Cas9介导的原生质体转化方法,成功获得Y-27632供应商了辣椒疫霉PcDHCR7基因纯合敲除突变体,并测定了PcDHCR7基因敲除后对辣椒疫霉不同发育阶段和致病力等的影响,结果显示突变体的菌丝生长速率和致病力均显著下降,芽管不能正常伸长并伴有顶端菌丝分支异常、畸形等现象。进一步结合酵母异源表达系统对其开展了酶活研究,发现与辣椒疫霉亲本菌株相比,PcDHCR7基因敲除突变体丧失了甾醇Δ7还原酶活性,即无法将麦角甾醇转化为菜籽甾醇。上述结果表明,辣椒疫JQ1化学结构霉虽为甾醇缺陷型生物,但其PcDHCR7仍保留了甾醇Δ7还原酶的酶活,并在病原菌的生长发育中发挥着重要功能。

目的 分析莫沙必利辅助四联疗法对功能性消化不良幽门螺杆菌阳性患者临床疗效的影响。方法 选取功能性消化不良幽门螺杆菌阳性患者100例，随机分为对照组和观察组，各50例。两组患者均予以健康指导、抗幽门螺杆菌四联疗法治疗。观察组患者再予以莫沙必利辅助治疗。两组患者均连续治疗2周。比较两组治疗情况。结果 治疗2周后，两组患者GAS级MTL水平均较治疗前上升，且观察组高于对照组(P<0.05);观察组患者临床症状缓S63845纯度解时间短于对照组，满意度高于对照组(P<0.05);观察组临床总有效率高于对照组(P<0.05);两组患者治疗期间药物不良反应率组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 莫沙必利辅助抗幽门螺杆菌四联疗法可有效恢复功能性消化不良幽门螺杆菌阳性患者胃肠激素确认细节平衡，缩短患者临床症状缓解时间，提高患者对治疗满意率，综合提升临床治疗总有效率Bio-controlling agent，且并未增加患者药物不良反应率，是治疗功能性消化不良幽门螺杆菌阳性患者的优选方案。

[摘 要]目的探讨天获悉更多然植物化合物樱黄素（PRU）对肠上皮细胞炎症和屏障结构的作用及其对小鼠克罗恩病样结肠炎的影响。方法建立脂多糖（LPS）诱导的结肠类器官炎症损伤模型和2，4，6-三硝基苯磺酸溶液(TNBhttps://www.selleck.cn/products/LBH-589.htmlS）诱导的小鼠结肠炎模型，用于评估PRU对肠上皮炎症反应和肠屏障的影响。另外，使用网络药理学结合体内外研究分析PRU调控肠上皮炎症影响肠炎的分子机制。结果PRU干预可抑制LPS诱导的结肠类器官中促炎介质肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、IL-1β的释放以及改善TNBS诱导的小鼠结肠炎症状（T immunophenotype体重下降、疾病活动指数和炎症评分升高）；同时，PRU促进LPS诱导的小鼠结肠类器官TNBS小鼠肠上皮细胞间紧密连接蛋白闭锁小带蛋白1（ZO-1），密封蛋白1（claudin-1）的表达和改善移位，同时保护肠屏障结构。PRU可靶向结合Toll样受体4（TLR4）并抑制TLR4/髓样分化因子88（MyD88）信号通路活化。结论PRU可通过靶向拮抗TLR4/MyD88信号的激活，抑制肠上皮细胞炎症和保护肠屏障损伤从而改善克罗病样肠炎。

研究背景和目的原发性IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)作为全球最常见的原发性肾小球肾炎之一,是导致我国慢性肾功能衰竭的主要原因。近年来,在IgAN发病机制方面取得了一定的研究进展,但仍缺乏治疗IgAN的特异性疗法。目前导致IgAN进展的危险因素包括medical intensive care unit蛋白尿、高血压以及肾活检时估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)等已被早期识别并干预,然而,仍有部分患者在确诊后的20年内进展为终末期肾脏病(end-stage kidney disease,ESKD),因此,迫切地需要探索新的危险因素来预防IgAN的进展。目前有关血磷与IgAN进展的研究较少且尚未探讨过正常范围内的血磷水平与IgAN进展的关系,同时,血红蛋白与IgAN患者预后MRTX1133作用的关系仍然存在争议,故本研究通过对原发性IgAN患者进行回顾性分析,探讨在正常血磷参考范围内的不同血磷和血红蛋白水平与IgAN患者预后的相关性,以期寻找新的危险因素,为IgAN患者的临床治疗提供新思路。研究方法纳入2017年1月1日至2021年8月30日在山东大学齐鲁医院肾脏内科行经皮肾穿刺活检确诊且血磷正常的原发性IgAN患者作为研究对象,并对其进行随访。以肾活检时的临床数据作为基线资料,根据基线血磷和血红蛋白水平三分位数间距进行分组,以eGFR减少50%或达到ESKD为复合终点事件。分析基线不同血磷和血红蛋白水平与IgAN患者预后的相关性。研究结果1.共纳入162例IgAN患者作为研究对象,其平均年龄为(37.02±11.03)岁,平均血磷水平为(3.50±0.56)mg/dL,平均血红蛋白水平为(133.11±19.90)g/L。截止2022年3月1日,中位随访时间为16个月,共15例IgAN患者达到复合终点事件,其中eGFR减少50%12例,进展为ESKD13例。2.在正常血磷参考范围内,与低血磷水平组IgAN患者相比,高血磷水平组患者女性比例较高,血红蛋白和血白蛋白水平较低(均P<0.05);在正常范围内的不同血磷水平组间,患者病理特点差异不具有统计学意义(均P>0.05)。多因素Cox回归分析显示:高血磷水平组患者发生肾脏复合终点事件的风险是低血磷水平组患者的9.424倍(HR=9.424,95%CI:1.019-87.165,P=0.048)。3.与高血红蛋白水平组IgAN患者相比,低血红蛋白水平组患者女性比例及血磷水平较高,而体重指数(body mass index,BMI)、收缩压(systolic blood pressure,SBP)、舒张压(diastolic blood pressure,DBP)、平均动脉压(mean arterial pressure,MAP)、甘油三酯和血尿酸水平较低(均P<0.05);在不同血红蛋白水平组间,患者病理特点比较发现,低血红蛋白水平组患者肾小管萎缩/间质纤维化的程度较重(P<0.05),且通过多因素Logistic回归分析发现血红蛋白水平降低是IgAN患者肾小管萎缩/间质纤维化>25%的独立危险因素(OR=0.972,95%CI:0.948-0.996,P=0.025)。多因素 Cox 回归分析显示:作为连续变量,血红蛋白每增加1g/L,发生不良肾脏结局的风险降低2.9%(HR=0.971,95%CI:0.943-0.999,P=0.044),此外,作为分类变量,与低血红蛋白水平组患者相比,高血红蛋白水平组发生复合终点事件的风险更低(HR=0.070,95%CI:0.006-0.753,P=0.028)。4.多因素Cox回归分析显示:除血磷、血红蛋白外,基线尿白蛋白肌酐比(urine albumin to creatinine ratio,UACR)水平越高(Compound C体内实验剂量HR=1.415,95%CI:1.053-1.901,P=0.021)和eGFR水平越低(HR=0.947,95%CI:0.905-0.990,P=0.018)同样与不良肾脏结局独立相关。研究结论1.在正常血磷参考范围内,相对较高的血磷水平是IgAN患者发生不良肾脏结局的独立危险因素。2.血红蛋白水平降低是IgAN患者肾小管萎缩/间质纤维化>25%的独立危险因素,并且与IgAN患者的不良肾脏结局独立相关。

骨质疏松症（osteoporosis,OP）是一种以骨量减少、骨脆性增加为特征的慢性老年性骨病，诱发因素较多且发病机制复杂。探究OP机制，提高临Zinc-based biomaterials床疗效一直是生命科学领域的研究热点。近年来研究发现线粒体在OP发病机制中具有重要意义。线粒体能量代谢、线粒体氧化应激、线粒体自噬、线粒体介导的凋亡、线粒体动力学等功能异常均可通过不同信号通路、细胞因子及蛋白质表达干预骨髓间充质干细胞分化命运，调控成骨细胞活性及增殖分化，启动破骨细胞凋亡程序。因此以线https://www.selleck.cn/products/Puromycin-2HCl.html粒体为靶点，调节线粒体能量代谢、氧化应激、自噬、动力学等功能，诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，促进成骨细胞分化与矿化，诱导破骨细胞凋亡是防治OP的潜在策略。该文查阅国内外相关文献，就线粒体功能障碍在OP中的作BYL719小鼠用机制作一综述，以期为进一步研究奠定基础。

背景:随着肾移植手术技术的不断提高和免疫抑制剂的进步,肾移植短期疗效显著,但长期存活率未见明显改善。近50%的移植肾在术后10年左右出现移植肾功能衰竭进而需要重新恢复血液透析或二次移植治疗。近年来,非免疫因素的肾脏纤维化导致慢性移植肾失功备受关注,也是增加肾移植长期带功存活的难点。肾小管是肾脏重吸收和分泌功能的主要承担者。小管上皮细胞作为肾小管间质固有细胞高度参与肾脏损伤后的修复或纤维化过程。这些细胞主要依靠脂肪酸氧化提供能量。肾脏脂肪酸氧化受损是慢性肾病、癌症和纤维化等多种疾病发展进程中的常见特征。近期研究表明,肾小管上皮细胞中低水平的脂肪酸氧化能力与小管间质纤维化相关。糖酵解增加则会导致乳酸和脂质积累,进而加重酸中毒、组织损伤和纤维化。急性肾损伤和糖尿病肾病中糖酵解中间产物堆积导致有毒终端产物的生成,从而加剧纤维化进展。因此,糖脂代谢稳态对于维持肾脏正常功能至关重要,但其与移植肾纤维化之间的关系尚不明确。靶向恢复糖脂代谢稳态延缓移植肾纤维化进展是否可行以及具体疗效也有待进一步研究。肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)作为一种肿瘤抑制因子,与其最重要的下游靶点AMP依赖的蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK)是葡萄糖和脂肪酸代谢的关键调节枢纽,参与调控细胞极性、细胞周期阻滞、凋亡、能量代谢和造血干细胞维持等多种生物学进程。其信号通路受损导致的糖脂代谢紊乱可能在移植肾纤维化进程中发挥重要作用,但具体机制尚不清楚。目的:首先,验证移植肾纤维化中是否存在糖脂代谢紊乱以及LKB1-AMPK通路调控的糖酵解和脂肪酸氧化与移植肾纤维化之间的关系;其次,进一步明确LKB1-AMPK信号通路参与移植肾纤维化的具体机制;最后,探索靶向LKB1-AMPK信号通路恢复糖脂代谢稳态能否减轻移植肾纤维化并评价其保护肾功能的具体疗效,为延缓移植肾纤维化提供新的治疗策略和理论依据,为临床移植肾失功的防治及增加移植肾长期带功存活提供新的思路。方法:第一部分LKB1-AMPK信号通路受损导致糖脂代谢紊乱促进移植肾纤维化1.构建Brown Norway大鼠肾移植模型并进行移植肾非靶向代谢组学测序,明确纤维化的移植肾中是否存在糖脂代谢紊乱;2.获取临床移植肾穿刺样本的连续切片进行Masson和LKBProtein Tyrosine Kinase抑制剂1、p-AMPK的免疫组化染色,并结合公共数据库的移植肾基因组测序结果分析,明确LKB1-AMPK通路是否与移植肾纤维化程度相关;3.构建敲低LKB1的人肾近端小管上皮细胞HK-2(HK-2-shLKB1)和大鼠肾小管上皮细胞NRK(NRK-shLKB1)的稳转细胞系,并通过油红O和尼罗红染色观察细胞脂肪酸代谢改变,通过检测细胞外酸化率观察糖酵解能力改变情况;4.通过western blot及RT-qPCR技术明确shLKB1对HK-2和NRK细胞胶原分泌和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)重塑的影响;5.通过细胞划痕实验、Transwell细胞迁移实验、鬼笔环肽细胞骨架染色、western blot和RT-qPCR技术明确shLKB1对HK-2和NRK细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响;第二部分LKB1-AMPK信号通路受损导致移植肾纤维化的机制研究1.通过western blot、临床移植肾穿刺样本的连续切片进行Masson和过氧化物酶体增殖物激活受体α(perixisome proliferation-activated receptor alpha,PPARα)的免疫组化染色结果明确LKB1-AMPK-PPARα轴与移植肾纤维化程度的相关性;2.通过油红O、尼罗红染色、细胞ATP含量测定等方法明确应用非诺贝特靶向激活PPARα能否逆转shLKB1导致的脂肪酸代谢紊乱;3.通过western blot、RT-qPCR和细胞免疫荧光技术明确非诺贝特靶向激活PPARα能否逆转LKB1-AMPK-PPARα信号通路受损导致的胶原分泌增加、ECM重塑以及EMT进程;4.临床移植肾穿刺样本的连续切片进行Masson和LKB1、酰基辅酶A氧化酶1(acyl-Co A Oxidase 1,ACOX1)的免疫组化染色,并结合公共数据库的移植肾基因组测序、western blot结果分析,明确脂肪酸β氧化过氧化物酶体途径的LKB1-AMPK-PPARα-ACOX1通路是否与移植肾纤维化程度相关;5.构建敲低ACOX1的HK-2稳转细胞系(HK-2-shACOX1),明确ACOX1与纤维化的相关性;6.通过western blot、RT-qPCR和细胞免疫荧光技术明确过表达ACOX1能否逆转LKB1-AMPK-PPARα-ACOX1信号通路受损导致的胶原分泌增加、ECM重塑以及EMT进程;7.通过对HK-2-shACOX1细胞进行RNA sequence、western blot、RT-qPCR和对临床移植肾穿刺样本的连续切片进行Masson和己糖激酶1(hexokinase 1,HK1)的免疫组化染色,并结合公共数据库移植肾基因组测序结果分析,明确调控糖酵解的LKB1-AMPK-HK1通路是否与移植肾纤维化程度相关;8.通过western blot、RT-qPCR和细胞免疫荧光技术明确应用2-DG抑制糖酵解能否逆转LKB1-AMPK通路受损导致的肾小管上皮细胞胶原分泌增加、ECM重塑以及EMT进程;第三部分药物靶向恢复糖脂代谢稳态抑制移植肾纤维化1.通过western blot、RT-qPCR、油红O染色、尼罗红染色、细胞外酸化率测定、细胞ATP含量测定等方法明确应用A769662靶向激活AMPK能否调控肾小管上皮细胞的糖脂代谢紊乱;2.通过western blot、RT-qPCR和细胞免疫荧光技术明确应用A769662靶向激活AMPK恢复糖脂代谢稳态能否逆转LKB1-AMPK通路受损导致的肾小管上皮细胞胶原分泌增加、ECM重塑以及EMT进程;3.通过PAS染色、ELISA法测定TNF-α/IL-1β/MCP1、免疫组织化学染色及western blot检测IL-6及TNF-α明确应用二甲双胍处理能否减轻移植肾炎症反应;4.构建Brown Norway大鼠肾移植模型并应用非诺贝特、2-DG或二甲双胍处理,验证上述体外实验结果和对肾功能的保护作用。结果:第一部分LKB1-AMPK信号通路受损导致糖脂代谢紊乱促进移植肾纤维化1.Brown Norway大鼠移植肾中糖类化合物减少、脂质积累明显增加,证实发生了糖脂代谢紊乱;2.临床移植肾样本中LKB1和p-AMPK染色阴性区域的纤维化明显增加,公共数据库测序结果也表明LKB1、AMPK转录Laboratory Supplies and Consumables水平与移植肾纤维化程度呈负相关(P<0.05),表明移植肾中存在LKB1-AMPK信号通路受损并与纤维化相关;3.HK-2-shLKB1和NRK-shLKB1细胞中脂质积累和细胞外酸化率明显增加,表明其脂肪酸氧化能力受损的同时糖酵解能力增加;4.shLKB1导致HK-2和NRK细胞Ⅰ、Ⅳ型胶原分泌和ECM重塑相关基因的RNA和蛋白水平均增加;5.shLKB1导致HK-2和NRK细胞迁移能力增加、细胞形态由上皮细胞典型的鹅卵石样转变为纺锤形外观、EMT相关基因的RNA和蛋白水Z-VAD-FMK作用平增加,证实发生了EMT;第二部分LKB1-AMPK信号通路受损导致移植肾纤维化的机制研究1.临床移植肾样本中PPARα染色阴性区域纤维化明显增加以及shLKB1能够导致PPARα表达降低均证实PPARα作为LKB1-AMPK下游参与纤维化进程;2.非诺贝特靶向激活PPARα能够逆转shLKB1导致的细胞脂质积累和ATP含量下降;3.非诺贝特靶向激活PPARα能够逆转LKB1-AMPK-PPARα信号通路受损导致的Ⅰ、Ⅳ型胶原分泌增加、ECM重塑以及EMT进程;4.临床移植肾样本中ACOX1染色阴性区域纤维化明显增加、ACOX1与LKB1高度共定位以及shLKB1导致ACOX1表达降低证实ACOX1作为LKB1-AMPK-PPARα下游参与纤维化进程;5.shACOX1导致肾小管上皮细胞胶原分泌增加、ECM重塑以及EMT;6.过表达ACOX1能够逆转LKB1-AMPK-PPARα-ACOX1信号通路受损导致的胶原分泌增加、ECM重塑以及EMT进程;7.shACOX1后糖酵解相关基因转录水平明显增加,2-DG处理能够明显抑制胶原分泌相关基因的RNA水平;公共数据库分析也表明糖酵解关键酶基因的转录水平与移植肾纤维化程度呈负相关(P<0.05);同时临床移植肾穿刺样本中HK1染色阳性区域纤维化明显增加,这些结果表明LKB1-AMPK通路受损导致的纤维化与糖酵解增加有关;8.应用2-DG抑制糖酵解能够逆转LKB1-AMPK通路受损导致的肾小管上皮细胞Ⅰ、Ⅳ型胶原分泌增加、ECM重塑以及EMT进程;第三部分药物靶向恢复糖脂代谢稳态抑制移植肾纤维化1.应用A769662靶向激活AMPK能够减少细胞脂质沉积、降低细胞外酸化率并增加细胞ATP含量,证实其可以逆转肾小管上皮细胞的糖脂代谢紊乱;2.应用A769662靶向激活AMPK恢复糖脂代谢稳态能够逆转LKB1-AMPK通路受损导致的肾小管上皮细胞Ⅰ、Ⅳ型胶原分泌增加、ECM重塑以及EMT进程;3.二甲双胍处理能够减轻移植肾炎细胞浸润、组织TNF-α/IL-1β/MCP1/IL-6的水平,减轻移植肾炎症反应;4.体内实验证明在接受肾移植的Brown Norway大鼠中应用非诺贝特、2-DG或二甲双胍能够减轻移植肾纤维化并保护肾功能,其中二甲双胍的疗效最为显著。结论:1.纤维化移植肾中存在糖脂代谢紊乱,且与肾小管上皮细胞LKB1-AMPK信号通路受损相关;2.LKB1-AMPK信号通路受损导致肾小管上皮细胞发生EMT进而增加Ⅰ、Ⅳ型胶原分泌和ECM重塑;3.移植肾中主要是PPARα-ACOX1催化的过氧化物酶体途径脂肪酸β-氧化受损以及HK1催化的糖酵解增加导致糖脂代谢异常;4.应用非诺贝特、2-DG和二甲双胍靶向恢复糖脂代谢稳态均能够在一定程度上延缓移植肾纤维化,其中二甲双胍还能减轻炎症反应,对于保护肾功能具有更好的疗效。这些结果为理解移植肾纤维化复杂的分子机制提供了新的视角,为延缓移植肾纤维化增加移植肾带功时长提供了新的治疗策略。