RAF信号通路

试验旨在研究加味理中汤方对脾虚泄泻模型小鼠血常规、血糖及脏器指数的影响。试验中复方由干姜、党参、白术、甘草、茯苓、山药、木香、桂枝、砂仁组成。选择无特定病原体级ICR小鼠72只，随机分为6组，每组12只小鼠，雌、雄各半。除空白对照组（C组）小鼠灌胃同体积的生理盐水外，其余各组小鼠灌胃番泻叶提取物9 d建立脾虚泄泻模型。试验第10 d停用番泻叶，恩诺沙星治疗组（A组）小鼠灌胃恩诺沙星水溶液，各中药组分别给予低剂量（6.5 g/kg）、中剂量（13.0 g/kg）、高剂量（26.0 g/kg）灌胃治疗，C组和泄泻模型组（M组）用同体积的生理盐水灌胃，连续治疗3 d。结果显示，与C组相比，M组小鼠空腹血糖含量、淋巴细胞百分比、肝脏指数均极显著降低（P<0.01），血小板数目显著降低（P<0.05），中性粒细胞百分比及白细胞数目显著增加（P<0.01）。与M组比，各治疗组小鼠中性粒细胞百分比极显著降低（P<0.01），淋巴细胞百分及空腹血糖含量极显著升高（P<0.0AZD6738核磁1）；中药高剂量组（ZH组）小鼠血小板数目显Breast surgical oncology著提高（P<0.05），肝脏指数极显著提高（P<0.01）。与A组比，ZH组小鼠血糖含量、肝脏指数均极显著升高（P<0.01），血小板数目、肾脏指数均显著升高（P<0.05）。研究表明，加味理中汤方对脾虚泄泻小鼠的血常规、血糖及肝肾脏器指数等指标异常具有一定的改善作用，高剂Crizotinib化学结构量中药效果最佳且优于恩诺沙星。

目的 采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术，生物信息学分析技术及抗氧化活性实验推测蒙药珍宝丸挥发油的抗氧化能力和治疗类风湿关节炎（RA）的作用机制。方法 采用水蒸气蒸馏法提取珍宝丸中的挥发油，利用GC-MS对寻找更多挥发油成分进行定性分age of infection析。基于GC-MS分析结果，采用生物信息学分析技术对珍宝丸挥发油防治RA的主要成分、关键靶点及通路进行研究。同时，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH)法对挥发油抗氧化活性进行测定分析。结果 在珍宝丸中共鉴定出115个挥发油成分，其中相对百分含量前4CCRG 81045临床试验8的成分，占总挥发油含量的97.66%。生物信息学分析发现珍宝丸能够通过147个RA相关靶点，调控信号转导、炎症反应和蛋白质磷酸化等生物过程，干预PI3K-Akt、MAPK和RAS等信号通路发挥作用；分子对接结果显示珍宝丸挥发油中7个主要成分与5个核心靶点均可自发结合；抗氧化活性试验证明，珍宝丸挥发油具有较显著的抗氧化能力。结论 利用GC-MS高通量分析技术结合生物信息分析和抗氧化活性试验，推测了蒙药珍宝丸挥发油治疗RA的药效物质及作用机制，为珍宝丸挥发油成分的进一步研究提供理论依据。

目的 探讨中高危骨髓增生异常综合征（MDS）患者的化学药物治疗（简称化疗）方案及预后。方法 选取医院血液内科2015年1月至2020年10月收治的MDS国际预后评分系统（IPSS）危险分层为PD-0332991供应商中高危的MDS患者71例，按治疗方案的不同分为接受去甲基化药物（HMA）治疗组（HMA组）和HMA联合selleck PUN30119化疗组（联合化疗组）的，回顾性分析患者的临床资料，并进行疗效评估及生存分析。结果 与HMA组比较，联合化疗组患者治疗前的IPSS危险分层更严重，骨molecular pathobiology髓原始细胞百分比更高（P <0.05），疗效、总生存率（OS）、无白血病生存率（LFS）无显著差异（P> 0.05）。初诊时髓系原始细胞百分比小于分界值[4.395%，由接收者操作特征（ROC）曲线得到]的非化疗组患者的OS比化疗组更高（P=0.025 6），在髓系原始细胞百分比<10%的患者中得到相似结果。结论 部分MDS患者初诊时IPSS危险分层及骨髓原始细胞百分比较高，其可能需要行HMA联合化疗，但对于初诊时髓系原始细胞百分比小于4.395%的患者，化疗前需谨慎评估。

目的:近年来,随着化疗药物的临床使用,乳腺癌的生存率有所提高,但用药过程中获得selleck Barasertib性化疗耐药的产生,导致乳腺癌患者在根治性切除后仍有高复发率和远处转移。而谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)作为铁死亡信号传导的关键分子,是一种通过催化谷胱甘肽将脂质过氧化物转化为类脂醇的硒蛋白,其机制主要是通过打破氧化平衡,引起细胞内脂质活性氧(ROS)和脂质氧化物积聚,导致膜结构被破坏而激发铁死亡。目前研究表明,GPX4参与调控肿瘤的复发、耐药和预后。因此铁死亡有潜力成为乳腺癌治疗的新靶点。遗憾的是,到目前为止,只发现了10种调控铁死亡的抗肿瘤药物。因此,我们的目的是基于生物信息学和网络药理学手段,筛选出通过调控铁死亡途径,进而改善患者不良预后的抗乳腺癌创新药物。方法:1.以TCGA数据库中乳腺癌患者的转录组数据和临床数据为研究对象。通过limma包进行铁死亡差异基因分析,利用单因素Cox回归分析和Lasso Cox回归分析筛选预后基因并构建预后模型。2.基于铁死亡差异基因以及提示不良预后的乳腺癌基因通过CMap筛选出铁死亡相关的抗乳腺癌药物——环丝氨Talazoparib体内实验剂量酸3.CCK8法测定不同浓度L-环丝氨酸孵育条件下MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞以及MCF-10A和BEAS-2B正常细胞的生存能力。4.通过相关试剂盒和Western Blot技术检测两种乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7在药物孵育条件下,活性氧(ROS)、细胞内总铁水平以及铁死亡关键蛋白GPX4的表达水平。结果:1.我们通过”limma”包筛选出49个差异基因(28个上调基因和21个下调基因),利用单因素Cox回归分析筛选出CS、GCLC、EMC2、NQO1和G6PD五个预后基因,Lasso Cox回归分析纳入五个预后基因构建预后模型,根据中位数分数评分结果将患者分为高低风险两组患者。为进一步验证模型的正确性,我们进行差异分析发现参与模型构建的五个预后基因在高低风险两组之间基因的表达量具有统计学差异(P<0.001)。并且经过卡方检验分析高低风险组患者之间的年龄、性别、分期、T、M、N等临床特征,结果表明高低风险组患者之间的预后特征不受年龄等临床特征的影响(P>0.05)。为了验证风险评分的有效性,我们采用Kaplan-Meier分析和生存状态评估,发现高风险组患者总体生存率(OS)更差,且随着风险评分的增加,患者死亡人数增多,参与模型构建的基因表达均上调。这些研究成果说明我们的模型构建成功,且风险评分可以进行预后价值评估。2.我们通过CMap筛选出调控铁死亡,抑制乳腺癌患者不良预后基因的抗乳腺癌药物——环丝氨酸(肿瘤抑制组中enrichment=-0.762,P=0.00658;高风险基因抑制组中enrichment=-0.724,P=0.0118)。3.L-环丝氨酸以浓度依赖的方式显著抑制MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞的增殖,且对MDA-MB-231细胞抑制作用强于MCBiomass sugar syrupsF-7细胞;但L-环丝氨酸对乳腺上皮细胞MCF-10A和肺上皮细胞BEAS-2B的活力没有明显抑制作用。4.L-环丝氨酸显著促进了MDA-MB-231及MCF-7细胞内活性氧(ROS)和铁离子积累,同时明显抑制GPX4表达(P<0.05)。进一步,当铁死亡抑制剂Fer-1存在下,L-环丝氨酸对MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞的抑制作用被消除。结论:L-环丝氨酸通过诱导ROS和铁离子积聚,下调GPX4蛋白的表达,抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞的增殖而发挥药理学作用。我们认为L-环丝氨酸可以作为一种“新”的调控铁死亡治疗乳腺癌的临床潜在药物。

扩张期洋中脊热液循环系统的热排出与岩浆系统的热注入共同控制着洋壳厚度的生成，而岩浆流体glucose biosensors是热液循环系统的流体成分之一，往往与下渗海水混合参与各圈层能量和物质传递，但其能量传递对洋壳厚度的影响机制目前还不清楚.利用有限元的数值模拟手段，对扩张期热液循环系统中岩浆流体与洋壳厚度的关系进行研究.结果表明：(1)相较于只有海水参与的对流循环，含有岩浆流体的热液LY294002溶解度循环造成的洋壳厚度的减薄量更大、热液喷口温度更高.(2)岩浆流体对洋壳厚度的二次减薄作用随其含量的增大而减弱，热液喷口温度随其含量的增大而升高.(3)南海岩浆水、地幔水含量和洋壳厚度的分布具有非均质性，东部次海盆的地幔水、岩浆水含量高于西南次海盆，前者的平均洋壳厚度也大于后者，并且在海盆残余扩张脊附近存在异常薄洋壳.结合模型结果分析认为，残余扩张脊附近的薄洋壳可能受到扩张期热液循环或后期岩浆流体的影响，而东部、STM2457生产商西南次海盆的洋壳厚度差异可能是由于前者的岩浆流体含量高于后者而造成的.

目的 探索小selleckchem儿柴桂退热口服液联合开喉剑喷雾剂治疗手足口病的临床效果。方法 选取2021年11月至2023年2月我院儿科就诊的80例手足口病患儿，将按照随机数字表法将其分为观察组和对照组各40例。两组均给予隔离措施、抗病毒、加强营养、补液等对症支持治疗，观察组患儿在上述治疗基础上给予小儿柴桂退热口服液联合开喉剑喷雾剂治疗，对照组单一使用小儿柴桂退热口服液或开喉剑喷雾剂治疗，对比分析两组患儿临床症状改善时tick-borne infections间、治疗总有效率、不良反应发生率、住院时间和治疗费用。结果 观察组体温恢复正常时间、咽痛消失时间、皮疹消失时间、口腔溃疡愈合时间、进食恢复时间明显短于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。观察组治疗总有效率为95.00%，高于对照组的80.00%，差异Barasertib IC50有统计学意义（P<0.05）。两组不良反应发生率对比差异无统计学意义（P>0.05）。观察组住院时间、治疗费用均明显优于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 小儿柴桂退热口服液联合开喉剑喷雾剂治疗手足口病，可以有效减轻患儿症状，缩短住院时间，降低治疗费用，且不良反应发生率低，安全有效。

骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种常见的全身代谢性疾病，是造成骨折的主要原因之一，其发病机制较为复杂，不同原因引起的OP涉及了Nucleic Acid Analysis体内多种代谢途径的紊乱，近年来随着代谢组学在中医药治疗OP过程中的不断研究，发现脂代谢紊乱会抑制骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stemcells, BMSCs)向成骨细胞(osteoblast, OB)增殖分化，促进造血干细胞(stem cell, SC)向破骨细胞(osteoporosis, OC)的分化。其中，脂质异常聚集、炎症反应、氧化应激、氧化脂质、对氧磷酶(paraoxonase, PON)等因素对OB的增殖及分化具有负向调控作用，同时，脂代谢紊乱会使白细胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)等炎症因子的表达上调，产生氧化应激与炎症反应，导致OC分化及增殖和骨吸收加剧。近年来，中医药在预防和治疗OP方面的研究也逐渐增多，其疗效也得到了普遍认可，有诸多研究发现中药有效成分和中药复方可以通过靶向信号分子调控脂代谢的过程来影响OB和OC的分化，在纠正骨代谢失衡方面潜力巨大。因此，通过调控脂代谢相关靶点通路来预防和治疗OP已成为了当下研究热点，现通过对中医药防治OP的作用机制及相关靶点方面的Bafilomycin A1分子量研究进行整理，总结了中医药通过调控脂代谢关键LGK-974因子来治疗OP的部分机制，旨在为中医药防治OP的深入研究提供参考依据。

背景:牙周炎是以菌斑为始动因子,发生于牙齿支持组织的慢性炎症性疾病,其特点是牙槽骨慢性进行性的破坏,并可导致成年人牙齿丧失,影响人类的口腔健康。大量研究表AMG510体内实验剂量明牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)是慢性牙周炎活动性病变区最主要的优势菌,与牙周炎的发生发展密切相关。牙周免疫细胞在P.g及其毒力因子脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)的刺激下活化,通过“呼吸爆发”释放过量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)杀灭细菌。但过量分泌的ROS会对自身及周围组织细胞内脂质、DNA及蛋白质造成损伤。目前牙周炎的治疗药物主要包括硝基咪唑类及四环素类抗菌药物,但长期应用抗生素存在引起不良反应,产生耐药菌株导致菌群失调的缺点。而传统中药姜黄素不仅能发挥抑菌作用,还具有调控炎症、改善氧化应激状态和抑制细胞发生凋亡等多种生物学活性,被认为是一种有效的治疗牙周炎的天然化合物。目前,姜黄素通过抑制铁死亡从而改善组织损伤的研究受到关注,这种药理作用可能与姜黄素的抗氧化作用有关。铁死亡是一种由脂质ROS引起细胞膜结构破坏而导致细胞死亡的新型死亡方式,主要特征包括线粒体皱缩、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)耗竭以及脂质过氧化产物异常蓄积等。脂质过氧化物的异常积聚不仅是铁死亡发生的直接原因,还与牙周炎密切相关。有研究表明,牙周炎患者的血浆及唾液中都含有较高的脂质过氧化物。在小鼠牙周炎模型上发现其牙龈组织有铁死亡相关基因的变化,且该变化可被铁死亡抑制剂Fer-1逆转,对牙周炎发生发展过程中铁死亡的调控可能为改善牙周炎炎症反应提供新的治疗策略。鉴于此,本实验拟通过建立丝线结genetic fingerprint扎诱导的小鼠牙周炎模型及P.g-LPS刺激RAW264.7的体外炎症模型,采用分子生物学、免疫组织化学等多种手段,观察和检测姜黄素对牙周炎发生发展的作用是否经由了铁死亡相关的信号通路,进而探究姜黄素是否经由抑制铁死亡减轻牙周炎炎症反应的机制。方法:(1)体内实验用丝线结扎诱导小鼠牙周炎,通过检测小鼠血浆超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的酶活力,评估全身氧化应激状态;制作小鼠牙龈组织石蜡切片进行HE染色以比较牙龈上皮的炎症浸润程度;提取牙龈及颌骨组织的RNA和蛋白质,从基因及蛋白两方面进行溶质载体家族7成员11(Solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)及谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)的检测,同时对牙龈组织切片进行免疫组化染色,验证SLC7A11及GPX4表达情况;按照不同方法制作牙龈组织及牙槽骨组织匀浆以检测GSH、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,评价姜黄素对铁死亡分子标志物的影响。(2)体外实验采用P.g-LPS刺激RAW264.7,通过观察线粒体形貌,线粒体膜电位及线粒体ROS水平,证明姜黄素可维持线粒体形态稳定和功能正常;采用DCFH-DA探针检测ROS水平,评价姜黄素对细胞总ROS的清除作用;通过乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)释放,Calcein/PI细胞毒性检测及Annexin V-FITC细胞凋亡检测实验,证明姜黄素具有保护细胞的作用;检selleck激酶抑制剂测抑制铁死亡的通路蛋白SLC7A11及GPX4的表达水平,证实姜黄素可通过调控SLC7A11/GPX4轴发挥抑制铁死亡作用;通过检测抗氧化物GSH水平及脂质过氧化物MDA的积累,证明姜黄素促进脂质过氧化的清除,提高细胞对铁死亡的抵御能力。结果:(1)体内研究结果表明不同浓度的姜黄素可提高血清SOD酶活力,改善牙龈组织炎症浸润,上调SLC7A11及GPX4表达,提高牙龈及牙槽骨GSH含量,降低MDA累积。证实姜黄素可通过调控SLC7A11/GPX4轴抑制铁死亡,增高牙周组织内抗氧化物GSH含量,减少MDA积累,达到改善牙周炎炎症反应的作用。(2)体外研究结果表明不同浓度的姜黄素可改善线粒体形貌,提高线粒体膜电位,降低线粒体ROS及细胞总ROS水平,降低细胞的死亡率,提高SLC7A11及GPX4的表达,增高炎症细胞内GSH的含量,降低胞内MDA的异常累积。增强细胞的抗氧化能力。表明姜黄素可通过调控SLC7A11/GPX4轴抑制P.g-LPS刺激下RWA264.7的铁死亡现象。结论:(1)姜黄素对实验性小鼠牙周炎炎症具有调控作用,可减少牙周组织局部炎性浸润,保护牙周组织。(2)姜黄素通过调控SLC7A11/GPX4通路抑制牙周炎脂质过氧化物累积,进而保护牙龈及牙槽骨组织细胞。(3)姜黄素可维持炎症状态下RAW264.7细胞内线粒体形态稳定和功能正常,发挥对细胞的保护作用。(4)姜黄素影响巨噬细胞内铁死亡相关基因SLC7A11及GPX4的表达,推断姜黄素减轻牙周炎炎症的机制是通过调控SLC7A11/GPX4轴抑制细胞铁死亡现象实现的。

研究目的:Notch信号通路由4种受体、5种配体和下游靶基因组成,具有调控细胞增殖、分化和凋亡的功能。Notch1-4受体为跨膜蛋白,结构高度相似,但功能不同,有关运动对Notch1-4受体的影响还未见文献报道,故本研究通过有氧运动和抗阻运动对大鼠肾脏和骨骼肌中Notch1-4受体表达的影响,分析不同运动模式下Notch1-4受体的可能生物学机制,为运动模式下Notch信号通路的各途径研究,筛选出具有蛋白表达信号的受体。研究方法:本研究得到了成都体育学院伦理委员会批准,批准号为[2022]58号。(1)将24只雄性SD大鼠随机分为对照组(C组,n=8)、有氧训练组(AE组,n=8)和抗阻训练组(RE组,n=8)。(2)有氧运动干预方案:3天跑台适应性训练后,进入正式运动干预。第1天跑台坡度0°,速度16m/min、时间5min;第2天与第3天,坡度与速度不变,时间分别为10min、15min;3天后,大鼠以20m/min、60min/d、5d/w的强度进行训练,共计8周。抗阻运动干预方案:适应性无负重爬梯训练3天后,在尾部负重递增负荷训练3天。之后进入正式抗阻训练,尾部分别负重50%、75%、90%、100%,每一个负重级别爬行3次,100%最大负重时,如不能完成3次者以实际运动能力为限,5d/w,共计8周。(3)8周运动干预后,分别取大鼠左肾和左股四头肌,分成2份。一份置于4%的多聚甲醛固定液中,4°冰箱保存,用于HE染色的组织学观察、免疫组化检测的定位和相对定量研究。另一份装入冷冻管中,液氮急冻后-80°冰箱保存,用于免疫印迹法的半定量研究。使用SPSS26.0软件进行统计学检验,首先进行正态分布和方差齐性检验,如符合正态分布和方差齐性,进行单因素方差分析,如不符合,则使用秩和检验。研究结果:(1)HE染色的组织形态学观察。(1)肾脏:C组未见结缔组织增生及炎性渗出;皮质区肾小球未见毛细血管基底膜增生,无变性、坏死及纤维化;肾小管结构较为完整,间质未见明显炎性浸润及纤维增生;近曲小管与远曲小管界限清晰。AE组肾脏组织未见结缔组织增生及炎性渗出;皮质与髓质分界较为清晰,其中2例皮质区肾小球轻微肿大,肾小囊腔明显变小;肾小管结构较为完整,少量肾小管上皮细胞胞质空泡化,1例少量肾小管变性坏死,见上皮细胞胞质空泡化,胞核固缩,少量上皮细胞脱落;间质未见明显炎性浸润及纤维增生;髓质集合管结构完整清晰,其他未见明显病理改变。RE组肾脏组织未见结缔组织增生及炎性渗出;皮质与髓质分界较为清晰,系膜细胞与毛细血管内皮细胞轻中度肿胀,肾小囊腔隙变窄;间质未见明显炎性浸润及纤维增生;髓质集合管结构完整清晰,其中1例皮质区肾小球轻微肿大,少量肾小管变性坏死;间质未见明显炎性浸润及纤维增生;髓质集合管结构完整清晰。(2)骨骼肌:C组肌纤维呈长圆柱状,排列整齐,肌束结构清晰,边界分明,肌纤维形态正常,细胞核呈扁圆形或椭圆形,偶见部分肌纤维胞质染色不均,无波浪样、空泡或脂肪变性,未见明显坏死;间质未见明显炎购买AZD1152-HQPA细胞浸润和增Cobimetinib NMR生。AE组肌纤维呈长圆柱状,排列整齐,肌束结构清晰,边界分明,肌纤维形态正常,其中4例局部区域部分肌纤维轻微至轻度波浪样变,未见明显坏死;间质未见明显炎细胞浸润和增生。RE组肌纤维呈长圆柱状,排列整齐,肌束结构清晰,边界分明,肌纤维形态正常,其中1例局部区域少量肌纤维轻微波浪样变,未见明显坏死;间质未见明显炎细胞浸润和增生。(2)免疫组化检测研究。(1)肾脏:Notch1-4的阳性产物分布在肾小管的上皮细胞和足细胞、近端小管和远端小管的上皮细胞中,为胞质表达;Notch1蛋白水平AE组、RE组较C组呈显著性升高(P<0.05),Notch2蛋白水平AE组、RE组较C组呈极显著性升高(P<0.01),Notch3和Notch4蛋白水平未出现显著性变化。(2)骨骼肌:Notch1-4的阳性产物分布在肌纤维的胞浆中,也为胞质表达。Notch1蛋白水平AE组、RE组较C组呈极显著性升高(P<0.01),Notch2蛋白水平AE组较C组呈极显著性升高(P<0.01);Notch3和Notch4蛋白水平未出现显著性变化;(Ocular genetics3)肾脏与骨骼肌组织比较,各指标均未出现显著性差异变化。(3)免疫印迹法研究。(1)肾脏:Notch1蛋白水平AE组较C组呈显著性升高(P<0.05)、AE组较RE组呈极显著性升高(P<0.01);Notch2蛋白水平AE组、RE组较C组呈显著性升高(P<0.05),Notch3和Notch4蛋白水平未出现显著性变化。(2)骨骼肌:Notch1蛋白水平AE组、RE组较C组呈显著性升高(P<0.05),Notch2蛋白水平AE组、RE组较C组呈极显著性升高(P<0.01),Notch3和Notch4蛋白水平未出现显著性变化。(3)肾脏与骨骼肌组织比较,各指标均未出现显著性差异变化。研究结论:(1)有氧运动和抗阻运动使肾脏和骨骼肌组织有轻度病理改变,提示为组织重塑与功能提升打下基础;(2)Notch四种受体的细胞内结构域尽管高度相似,但在不同运动模式及不同部位的信号强度均未出现同步变化,即信号强度的不一致是Notch四种受体在不同组织产生功能差异的原因之一。(3)运动干预后,Notch1和Notch2受体在肾脏和骨骼肌中表达增加,其可能性机制是参与了血管内皮细胞和骨骼肌卫星细胞的分化与增生,故在有氧和抗阻运动模式下,可筛选出Notch1和Notch2受体作为Notch信号通路中与配体结合的研究对象。

目的:甲状腺癌(thyroid cancer,TC)是最常见的内分泌系统恶性肿瘤,随着甲状腺癌总体发病率的增加,晚期甲状腺癌的发病率和死亡率均呈上升趋势。肿瘤耐药是改善晚期甲状腺癌患者预后的主要障碍。Lenvatinib是一种口服、多靶向酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKI),能对不同组织学病理亚型的甲状腺癌患者发挥抗肿瘤活性,但用药不良事件的频繁发生和肿瘤耐药的出现限制了患者临床获益的最大化。BRAF作为丝裂原活化蛋Dolutegravir IC50白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号级联通路的核心组成成分,与多种药物治疗抵抗密切相关。BRAF突变是甲状腺癌中最常见的分子事件,能够激活下游的细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信号通路,促进肿瘤发生、增殖、分化和生存,维持甲状腺癌的恶性表型。本文通过构建人甲状腺癌Lenvatinib耐药细胞系,旨在分析人甲状腺癌中Lenvatinib耐药的原因,探讨了BRAF突变调控ARNTL参与Lenvatinib耐药的机制,并寻找可能的克服Lenvatinib耐药的小分子药物,为Lenvatinib进一步的临床应用提供参考,从而改善晚期甲状腺癌患者的预后。方法:首先选取KTC-1和8505C两种人甲状腺癌细胞系,通过梯度增加持续刺激的药物浓度构建耐药细胞系。利用转录组测序及TCGA数据库生信分析可能参与耐药的分子及通路。利用CCK-8实验、平板克隆实验检测药物浓度、BRAF及ARNTL表达水平对细胞增殖的影响。利用ROS、MDA、GSSG/GSH试剂盒检测药物、BRAF及ARNTL表达水平对细胞内氧化应激水平的影响。利用小干扰RNA(si RNA)、质粒、慢病毒构建BRAF、ARNTL、CREB干扰/过表达细胞系。利用q RT-PCR和Western Blot检测BRAF、ARNTL、CREB基因的转染效率、细胞系中BRAF、ARNTL、CREB基因间的调控作用及小分子药物对凋亡/铁死亡相关蛋白的表达影响。利用双荧光素酶报告基因和CHIP实验验证CREB与ARNTL启动子的结合作用及转录调控作用,以及BRAF对这种调控作用的影响。利用流式细胞术检测细胞内ROS水平及药物对细胞凋亡水平的影响。利用透射电镜观察药物耐药细胞发生铁死亡的超微细胞结构改变。利用荧光显微镜观察细胞内ROS和脂质过氧化物的改变。利用裸鼠成瘤实验检测了体内BRAF突变细胞系中ARNTL的表达水平对Lenvatinib药物敏感性的影响。结果:成功构建了KTC-1-R和8505C-R两种人甲状腺癌Lenvatinib耐药细胞系。耐药株KTC-1-R和8505C-R相比于亲本株KTC-1和8505C能够明显抵抗Lenvatinib的肿瘤抑制作用。高通量测序分析发现MAPK/ERK信号通路与肿瘤Lenvatinib耐药密切相关,由于BRAF突变对ERK信号通路的激活作用,BRAF突变可能参与甲状腺癌Lenvatinib耐药。功能富集分析发现甲状腺癌Lenvatinib耐药与细胞内氧化还原、ROS代谢等反映细胞氧化应激水平的通路相关。比较耐药细胞株与亲本细胞株细胞内ROS、MDA、GSSG/GSH水平发现耐药细胞株相对于亲本细胞株具有较高的氧化应激水平和抗氧化能力。BRAF突变状态能改变细胞内氧化应激水平进而影响细胞对Lenvatinib的敏感性。TCGA数据库分析ARNTL在BRAF突变样本中高表达,且与临床侵袭特性相关。ARNTL在耐药细胞株中高表达,并通过发挥抗氧化作用参与调控甲状腺癌Lenvatinib耐药。干扰ARNTL后,细胞内ROS水平明显增加,对Lenvatinib的敏感性增强;过表达ARNTL后,细胞内ROS水平明显下selleckchem降,细胞增强对Lenvatinib对耐药。BRAF突变可上调ARNTL的表达,促进其发挥抗氧化作用,进而参与Lenvatinib耐药。BRAF突变通过激活p-ERK,促进CREB核内磷酸化,从而上调ARNTL的表达。CREB能够与ARNTL启动子结合,激活转录调控,促进其表达;干扰BRAF后能抑制CREB对ARNTL的启动子的激活作用。BRAF突变质粒的插入可以促进ARNTL介导的Lenvatinib耐药,共转染si-CREB后减弱了对Lenvatinib的耐药。体内BRAF突变细胞系中,Lenvatinib对耐药细胞株的肿瘤抑制作用明显低于亲本细胞株,干扰ARNTL表达后细胞对Lenvatinib的药物敏感性增加,过表达ARNTL后,细胞对Lenvatinib的药物敏感性减弱。小分子药物筛选发现,Vitamin C能显著抑制人甲状腺癌Lenvatinib耐药细胞的增殖。Vitainfectious ventriculitismin C通过抑制p-ERK通路抑制ARNTL的表达,并显著增加耐药细胞株细胞内ROS水平,进而诱导耐药细胞死亡。Vitamin C能够显著增加耐药细胞株的凋亡比例,并影响凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-7和BCL-2的表达下降,以及Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-7的表达升高。Vitamin C能够诱导细胞铁死亡,表现为细胞内线粒体内嵴皱缩,线粒体膜断裂,细胞内脂质过氧化物水平增加,并下调铁死亡抑制相关蛋白Nrf2、SLC7A11、GPX4的表达水平。Vitamin C与Lenvatinib联合应用能有效抑制甲状腺癌Lenvatinib耐药细胞的活力。结论:成功构建人甲状腺癌Lenvatinib耐药细胞系后发现,BRAF突变通过激活p-ERK促进CREB的核内磷酸化,CREB与ARNTL启动子结合促进ARNTL表达发挥抗氧化作用,参与甲状腺癌Lenvatinib耐药;Vitamin C通过p-ERK抑制ARNTL的表达,显著增加耐药细胞株细胞内ROS水平,诱导耐药细胞株发生凋亡/铁死亡克服Lenvatinib耐药。