RAF信号通路

目的:为Y-27632了满足系列食品中食源性致病菌携带的β-内酰胺类抗生素耐药机制快速检测需求,开展了携带此类抗生素耐药性编码基因沙门氏菌参考菌株定性标准样品的研制,以提供溯源性强、评价准确度高、易在各检测机构间开展耐药微生物检测的技术保障。方法:活化实验室-80℃保存的3株沙门氏菌,通过PCR、DNA测序和BLAregulation of biologicalsST比对验证其所携带的β-内酰胺类抗生素耐药机制编码基因,同时检验目标基因的遗传稳定性。在真空冷冻干燥条件下制备活菌量为106～107CFU/瓶的菌株标准样品。按照GB/T 150RSL3生产商00.3-2008要求对参考菌株标准样品进行均匀性检验,使用方差分析法(F检验)对结果进行统计分析、均匀性评价。分别于37,4℃和-80℃模拟运输和贮藏条件,检验参考菌株的稳定性。委托具有检验资质的7家实验室对参考菌株进行联合定值。结果:3株候选参考菌株中1株同时携带β-内酰胺类抗生素耐药机制编码基因blaCTX-M-55/blaTEM-1,1株同时携带blaTEM-1/blaOXA-1/blaCTX-M-l5,1株携带blaCTX-M-3,在15代内均可稳定遗传。制备的参考菌株均匀性良好。在37℃贮藏13 d,4℃贮藏90 d,-80℃贮藏360 d,活菌量基本稳定在×104CFU/瓶以上。7家实验室联合定值结果表明,制备的参考菌株特性值与目标一致,可作为标准样品使用。结论:遵循标准样品制备标准和规范,研制了3株适于β-内酰胺类抗生素耐药机制检测用参考菌株,可用于食源性细菌β-内酰胺类抗生素耐药机制的快速检测。

目的 评价真实世界中替雷利珠单抗联合化疗在治疗尿路上皮癌中的疗效及安全性。方法 纳入32例行替雷利珠单抗联合化疗(吉西他滨/顺铂或紫杉醇)的尿路上皮癌患者资料，统计分析治疗期间出现的治疗相关不良反应发生率及疗效评估。结果 患者分组：替雷利珠单抗联合紫杉醇组15例，替雷利珠单抗联合GC组17例。共24例患者获得有效疗效分析，总体的客观缓解率(ORR)为54.2%，疾病控制率(DCR)为83.3%。在替雷利珠单抗联合紫杉醇组和替雷利珠单抗联合GC组中ORR分别为50.0%与58.3%，DCR分别为75.0%和91.7%。32例患者常selleck NSC 119875见的治疗相关不良反应包括贫血(56.3%)、食欲下降(53.1%)、皮肤瘙痒(50.0%)，3～4www.selleck.cn/products/ch-223191级不良反应发生率为21.8%。其中常见的免疫相关不良反应包括皮肤毒性(5Phage enzyme-linked immunosorbent assay3.1%)、免疫性结肠炎(9.4%)。结论 替雷利珠单抗联合化疗治疗尿路上皮癌患者疗效显著，安全可控，但应注意免疫相关性不良反应。

辛味食材往往具有药食同源的特性,常表现一定的临床功效,利用其具有的辛味特征开发活性物质成为近年来的研究热点。桔梗作为临床常用主入肺经的辛味中药,具有宣肺祛痰,利咽排脓的功效。瞬时受体电位A1(TRPA1)能够感受多种有害刺激(如冷热、刺激化合物以及与细胞损伤相关的内源性物质),是传感辛味的经典受体之一,在呼吸道及肺部大量分布,与呼吸道疾病的发生息息相关。具有辛味特征的药食品种及其活性成分可能通过TRPA1的介导发挥其相应功效,因此,本论文利用表达TRPA1蛋白的组织和细胞膜作为电化学生物传感器的传感元件筛选桔梗中的辛味成分,为揭示食源辛味物质的生物作用机制提供一定的理论依据。本论文以表达TRPA1的组织和细胞膜作为传感元件分别构建生物传感器,利用组织传感器使用JT010作为TRPA1特异性激动剂建立了TRPA1激活/抑制模型,测定了A967079、桔梗皂苷元、桔梗皂苷D、桔梗皂苷D_2、桔梗皂苷D_3及去芹菜糖桔梗皂苷D的抑制作用及类型。再根据以上结果使用细胞膜传感器测定了具有抑制作用的化合物对TRPA1的作用强度。TRPA1蛋白与桔梗单体的作用规律与酶促反应动力学相似,因此可以根据酶与底物的作用规律探D-Lin-MC3-DMA体内索分析TRPA1与桔梗中各化学成分的动力学参数,计算得到桔梗单体对TRPA1的抑制常数K_i和激活常数K_a。利用分子对接技术,通过上述实验结果确定TRPA1蛋白的活性位点,通过盲对接模拟分析了各化合物与TRPA1的结合强度与作用位点。主要研究成果如下:(1)将猪舌上皮组织固定在两个核微孔膜中间,通过淀粉-海藻酸钠溶液固定制成“三明治”夹层,构建组织生物传感器。以JT010作为特异性激活剂,建立激活/抑制模型,测定了六种桔梗单体对TRPA1通道的抑制作用。结果显示,A967079是JT010的反竞争性抑更多制剂,桔梗皂苷元、桔梗皂苷D、桔梗皂苷D_2、桔梗皂苷D_3、去芹菜糖桔梗皂苷D是JT010的非竞争性抑制剂,其抑制常数分别为K_(i A967079)=-8.639×10~(-11)mol/L、K_(i桔梗皂苷元)=16.621×10~(-11) mol/L、K_(i桔梗皂苷D)=7.483×10~(-11) mol/L、K_(i桔梗皂苷D2)=medical group chat7.148×10~(-11) mol/L、K_(i桔梗皂苷D3)=5.016×10~(-11) mol/L、K_(i去芹菜糖桔梗皂苷D)=5.601×10~(-11) mol/L,6种抑制剂的抑制强度为:A967079>桔梗皂苷D_3>去芹菜糖桔梗皂苷D>桔梗皂苷D_2>桔梗皂苷D>桔梗皂苷元。(2)用全基因合成和脂质体转染的方法构建了TRPA1蛋白异源表达体系。利用全基因合成将人源TRPA1的基因序列克隆至pc DNA3.1(+)表达载体中,然后将含有TRPA1序列的DNA转化至大肠杆菌感受态细胞从而获得工程菌株。再通过划线培养扩增大肠杆菌从而批量获得含有TRPA1基因的质粒DNA。接下来利用脂质体转染技术将目的质粒转染至HEK293细胞中,加入G418抗生素筛选稳定表达TRPA1蛋白的HEK293细胞株。通过琼脂糖凝胶电泳和Western Blotting实验证实了含TRPA1基因的质粒载体构建成功及TRPA1蛋白在HEK293细胞的细胞膜上稳定表达。构建成功的TRPA1-HEK293细胞株可用于TRPA1的后续研究。(3)通过层层修饰构建表达TRPA1蛋白的细胞膜生物传感器,采用时间电流曲线法(i-t)进行测定,各物质的激活常数分别为K_a _(JT010)=7.935×10~(-19)mol/L、K_(a桔梗皂苷元)=1.002×10~(-17) mol/L、K_(a桔梗皂苷D)=1.306×10~(-16) mol/L、K_(a桔梗皂苷D2)=1.476×10~(-16) mol/L、K_(a桔梗皂苷D3)=5.419×10~(-18) mol/L、K_(a去芹菜糖桔梗皂苷D)=1.539×10~(-15) mol/L,作用强度为JT010>桔梗皂苷D_3>桔梗皂苷元>桔梗皂苷D>桔梗皂苷D_2>去芹菜糖桔梗皂苷D。该细胞膜生物传感器可用于TRPA1通道激活剂的筛选。(4)通过利用分子对接技术建立TRPA1受体-桔梗单体虚拟筛选模型,分析了TRPA1蛋白和化合物单体之间主要的作用力有氢键和范德华力。计算受体与配体之间的结合自由能,预测受体与配体之间亲和力,结合自由能从小到大依次排序为:桔梗皂苷D_3?去芹菜糖桔梗皂苷D?桔梗皂苷元?桔梗皂苷D_2?桔梗皂苷D;桔梗单体与TRPA1蛋白之间的亲和力排序为:桔梗皂苷D_3>去芹菜糖桔梗皂苷D>桔梗皂苷元>桔梗皂苷D_2>桔梗皂苷D。根据上述研究结果,桔梗中的桔梗皂苷元、桔梗皂苷D、桔梗皂苷D_2、桔梗皂苷D_3、去芹菜糖桔梗皂苷D是可以通过TRPA1受体介导发挥作用,并可以抑制TRPA1离子通道的打开。本论文构建的两种类型生物传感器利用表达有TRPA1蛋白的组织和细胞膜作为生物传感器的传感元件可成功用于桔梗辛味物质的筛选。

目的:研究代谢综合征(metabolic syndrome, MS)与乳腺癌新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy, NAC)病理完全缓解(pathological complete response, pCR)的关系。方法:收集2014年01月至2020年06月在哈尔滨医科Chinese patent medicine大学附属肿瘤医院接受NAC后进行手术的女性乳腺癌患者526例，并收集患者的临床病理PLX3397资料，根据MS诊断标准分为MS组99例与非MS组427例。采用Logistic回归模型进行单因素和多因素分析MS与pCR的关系。结果:105例患者NAC后获得pCR,其中MS组10例，非MS组95例。单因素分析显示：非MS组较MS组更易获得pCR(P=0.008),激素受体(hormone receptor, HR)阴性、人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)阳性、Ki-67>14%者更易获得pCRwww.selleck.cn/products/Vorinostat-saha(P<0.001、P<0.001、P=0.002)。多因素分析显示：与HR阴性者相比，HR阳性者较难获得pCR(P<0.001);与HER-2阴性者相比，HER-2阳性者pCR率更高(P=0.033);与非MS患者相比，合并MS患者更难获得pCR(P=0.041)。亚组分析显示：非MS组中HR阴性患者更易获得pCR(P<0.001)。结论:HR状态、HER-2状态及MS是乳腺癌NAC后pCR的独立预测因素，合并代谢综合征的乳腺癌患者接受新辅助化疗后更难获得病理完全缓解，与长期预后相关性有待进一步研究。

目的:探讨参归宁心合剂治疗冠心病稳定型心绞痛气阴两虚兼瘀证的临床疗效。方法:选取冠心病稳定型心绞痛气阴selleckchem Dolutegravir两虚兼瘀证患者98例，随机分为两组，对照组49例，观察组49例。对照组采用常规西医治疗，观察组在对照组基础上采用参归宁心合剂治疗。比较两组临床疗效、中医症状积分、血脂指标、炎症指标。结果:治疗后，观察组胸闷、胸痛、心悸、乏力、气短症状积分低于对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。治疗后，观察组超点击此处敏C反应蛋白、同型半胱氨酸、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇低于对照组，高密度脂蛋白胆固醇高于对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。观察组总有效率为63.33%高于对照cholestatic hepatitis组的36.67%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:参归宁心合剂可提高冠心病稳定型心绞痛气阴两虚夹瘀证的临床疗效，改善患者临床症状，降低血脂水平，减轻炎症反应。

红仁核桃是近年来栽培的核桃新品种，富含蛋白质和多种营养素，具有降血脂等多种保健功能。本文采用正交试验设计优化碱性蛋白酶酶解红仁核桃分离蛋白的工艺参数，以高血脂SD大鼠为模型，分别以红仁核桃多肽的低、中、高剂量（200、400、800 mg/（kg·BW））饲喂大鼠，测定大鼠体重、脏器重量和血清指标，并进行组织切片观察。结果表明红仁核桃分离蛋白最优酶解条件为：酶解pH 9.0，底物浓度4.0%，酶加入量4.0%，酶解温度55.0℃，在此条件下水解度（DH）达到6.96%。用红仁核桃分离蛋白酶解产物灌胃SD大鼠后能显著减缓大鼠体重、肝脏、肾脏和附睾脂肪组织重量的增加（P< 0.05），显www.selleck.cn/products/Nafamostat-mesylate著降低大鼠血清总胆固醇含量、甘油三酯含量、低密度脂蛋白含量、动脉粥broad-spectrum antibiotics样硬化指数（P< 0.05），防止高密度脂蛋白降低。红AMG510化学结构仁核桃分离蛋白酶解产物多肽具有较好的降血脂功能。

目的：探讨姜黄素(curcumin, CUR)对锰中毒大鼠神经损伤的干预效应及其机制。方法：成年雄性SD大鼠60只，随机分为5组，每组12只。(1)空白对照组：通过腹腔注射(intraperitoneal injection, ip)给予0.9%(质量分数)生理盐水，并通过灌胃(intragastric, ig)给予双蒸水(double distilled water, ddH_2O);(2)锰中毒模型组：ip给予MnCl_2 15 mg/kg(Mn~(2+) 6.48 mg/kg),ig给予ddH_2O;(3)单独姜黄素组：ip给予0.9%生理盐水，ig给予CUR 300 mg/kg;(4)MnCl_2+CUR1组：ip给予MnCl_2 15 mg/kg, ig给予CUR 100 mg/kg;(5)MnCl_2+CUR2组：ip给予MnCl_215 mg/kg, ig给予CUR 300 mg/kg)。5组大鼠每周给药5 d,连续给予4周。旷场实验、转棒实验检测动物的探索行为、焦虑抑郁状态、运动及平衡能力，Morris水迷宫(Morris water maze, MWM)实验检测动物的学习、记忆能力。每组6只大鼠进行脑纹状体HE染色和免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)检查，并且其中2只大鼠一侧纹状体进行透射电镜(transmission electron microscope, TEM)观察。每组另外6只大鼠的一侧纹状体利用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定锰含量，另一侧纹状体用免疫印迹(Western blotting, WB)检测α-突触核蛋白(α-Syn3-MAuclein,α-Syn)、细胞质和细胞核转录因子EB(transcription factor EB,TFEB)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)、p-mTOR、Beclin1、P62和微管相关蛋白轻链蛋白3(microtubule-associated protein light chain-3,LC3)表达水平，脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transterase-mediated dUTP nick end labeling; TUNEL)检测大鼠纹状体多巴胺能神经元凋亡。结果：旷场和转棒实验中，锰中毒模型组水平运动距离、直立次数、中央区运动时间和运动距离、在棒时间、在棒圈数较空白对照组显著降低(P<0.05),而MnCl_2+CUR2组的上述指标均较锰中毒模型组显著增加(P<0.05)。MWM定位航行实验第3、4天时，锰中毒模型组逃避潜伏期和游泳距离显著高于空白对照组，而MnCl_2+CUR2组则显著高于锰中毒模型组(P<0.05)。MWM探索实验中，锰中毒模型组大鼠穿越平台次数、目标象限游泳时间、目标象限游泳时间百分比、目标象限距离及目标象限距离百分比显著低于对照组(P<0.05),而MnCl_2+CUR2组大鼠这些指标均较锰中毒模型组显著增加Porphyrin biosynthesis(P<0.05)。脑纹状体IHC和HE染色发现，锰中毒模型大鼠脑纹状体中酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)阳性多巴胺能神经细胞显著减少，嗜酸性细胞数量显著增加，MnCl_2+CUR1和MnCl_2+CUR2组TH阳性细胞显著增加，嗜酸性细胞减少，TEM观察发现，锰中毒模型组纹状体神经细胞出现染色质凝结，核固缩；线粒体水肿或空泡，可见溶酶体以及自噬泡。MnCl_2+CUR2组染色质凝结，核固缩，线粒体水肿、空泡等均较锰中毒大鼠明显改善，并可见更多的溶酶体以及自噬泡。免疫印迹检测发现，锰中毒模型组α-Syn表达水平较空白对照组显著增加，而MnCl_2+CUR2组聚集性α-Syn表达则较锰中毒模型组显著减少(P<0.05)。TFEB及自噬相关蛋白免疫印迹检测发现，与空白对照组比较，单独CUR组、锰中毒模型组、MnCl_2+CUR1和MnCl_2+CUR2组纹状体胞核TFEB表达均显著增加(P<0.05),与锰中毒模型组比较，MnCl_2+CUR1和MnCl_2+CUR2组其表达均显著增加(P<0.05);与空白对照组比较，各组mTOR、p-mTOR、P62蛋白表达水平显著降低，Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平则显著增加(P<0.05);与锰中毒模型组相比，MnCl_2+CUR1和MnCl_2+CUR2组大鼠脑纹状体中mTOR、p-mTOR及P62蛋白表达水平显著降低，Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平显著增加(P<0.05)。纹状体TUNEL检测结果发现，与空白对照组比较，锰中毒模型组和MnCl_2+CUR1组TUNEL阳性细胞显著增加(P<0.05);而与锰中毒模型组相比，MnCl_2+CUR2组TUNEL阳性细胞则显著降低(P<0.05)。结论：一定剂量的姜黄素干预可以减轻锰中毒大鼠纹状体多巴胺能Tezacaftor临床试验神经元损伤，改善锰中毒大鼠的神经行为症状，减少α-Syn聚集，减少细胞凋亡，其可能的机制是通过促进TFEB核转位增强细胞自噬。

目的 基于PI3K-Akt-mTOR通路探究黄芩苷(C_(21)H_(18)O_(11))对淋巴瘤细胞增殖及自噬的作用机制。方法 用CCK-8和细胞计数法检测不同质量浓度(0、50、100、200、400、800μg·mL~(-1))黄芩苷对淋巴瘤细胞系Raji细胞增殖的抑制作用，通过Annexin V-FITC/PI双染法及DAPI染色法观察细胞凋亡及自噬过程，用蛋白印迹实验检测黄芩苷对细胞凋亡和自噬过程上游机制的影响。结果 黄芩苷能够显著抑制磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inosiselleck Laduviglusibtol3-kinase, PI3K)、蛋白激酶B(alkaline protein kinases, Akt)、雷帕霉素靶蛋白(mammal target of rapamycin, mTserum biomarkerOR)蛋白的磷酸化，即显著降低p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的表达水平(P<0.01);黄芩苷能显著上调LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白的表达水平，抑制p62蛋白的表达(P<0.01),进而诱Fer-1价格导Raji细胞的凋亡和自噬。结论 黄芩苷可能通过抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制淋巴瘤细胞的生长，并通过提高LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白的表达水平从而抑制p62的表达，进而促进Raji细胞的凋亡和自噬过程。

微生物是合成天然产物的“细胞工厂”,能够利用体内的次级代谢网络将羧酸、氨基酸、糖类等小分子底物组装成为复杂多样的终产物,期间涉及大量蛋白酶的精密控制和协同作用。而这些蛋白酶的编码基因往往都是成簇存在的,也就是常说的生物合成基因簇(BGC)。合成生物学使能技术的快速发展促进了理想微生物“细胞工厂”的构建,通过设计改造微生物使之产生特定的天然产物,对微生物天然产物的生物合成途径改造主要涉及BGC的克隆、编辑和表达等。selleck抑制剂本文利用和开发前沿的合成生物学使能技术,如酿酒酵母转化偶联重组(TAR)、CRISPR/Cas9基因编辑以及Red/ET重组着眼于微生物天然产物的生产、改造和发现,旨在实现活性天然产物的高效合成、新型天然产物的结构衍生Belumosudil使用方法以及未知天然产物的定向挖掘。林可霉素是一种广谱抗生素,对多种致病菌具有良好的抑制作用。前期研究表明,敲除lmb V基因能够得到含有麦角硫因的林可霉素中间体。为了高效制备林可霉素及其重要中间体,使用CRISPR/Cas9-TAR偶联技术抓取了林可霉素BGC,并敲除了其中的lmb V基因。由此获得的基因簇在Streptomyces lividans TK24和Streptomyces coelicolor M145中进行异源表达。然而,重组菌株的发酵无法产生林可霉素及其中间体。通过RT-PCR实验发现林可霉素BGC在Streptomyces lividans TK24中没有被激活,后续需要尝试过表达正调控基因lmb U来激活相关基因簇。Sch40832是一种含有二氢咪唑并哌啶核心环的双环类硫肽,具有抗肿瘤活性。目前,对于Sch40832的生物合成机制仍然知之甚少。利用CRISPR/Cas9-TAR偶联技术成功抓取了Sch40832的BGC以便进行后续的一系列遗传操作进一步研究Sch40832的生物合成途径以及相关基因的功能研究。维里硫酰胺是一种含有特征硫酰胺键和烯基硫醚环的核糖体合成及后修饰肽,具有良好的诱导细胞凋亡活性。目前,对于维里硫酰胺的结构后修饰研究仍然有限。对敲除tva G _(S-87)和tva J_(S-87)基因的突变株进行发酵,通过LC-MS检测发酵产物推测维里硫酰胺的后修饰步骤。由于突变株中中间体的累积量太低,无法分离纯化目标化合物并鉴定结构,通过接合转移的方法成功将构建得到的的p JTU2554-?Autoimmune dementiatva G_(S-87)和p JTU2554-?tva J_(S-87)成功导入到?tva G_(S-87)和?tva J_(S-87)突变株,由此获得的重组菌株能够积累更多的目标化合物,有利于后续开展维里硫酰胺结构修饰反应的生化机制解析。

目的：探究雷帕霉素对川崎病（Kawasaki disease,KD）冠状动脉损害的抗炎作用及其分子机制。方法：体外培养人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cells,HCAEC），利用肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)刺激HCAEC 4 h以模拟KD的局部炎性病变BMN 673浓度，建立KD的细胞模型。整个实验分组为：对照组、TNF-α刺激组和TNF-α+雷帕霉素（50和100 nmol/L）组，雷帕霉素均于TNF-α刺激前24 h加入。通过RT-qPCR和Western blot检测各组炎症因子和自噬相关因子的mRNA及蛋白表达水平，并检测蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）信号通路和核因子κB(n此网站uclear factor-κB,NF-κB)的活化状态；单丹磺酰尸胺染色后用倒置荧光显微镜观察各组自噬泡的染色情况。结果：HCAEC经TNF-α刺激后炎症因子白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、IL-1β和IL-8的mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P<0.01），自噬相关蛋白beclin-1表达水平和LC3-II/LCImmediate Kangaroo Mother Care (iKMC)3-I比值显著下降（P<0.05）,p62表达水平显著上升（P<0.05），同时磷酸化的AKT、mTOR(P<0.01)及NF-κB(P<0.05)蛋白水平显著上升。经雷帕霉素处理后AKT/mTOR(P<0.01)及NF-κB(P<0.05)信号通路被抑制，自噬水平激活（P<0.05），各炎症因子的表达水平显著下降（P<0.01）。结论：雷帕霉素可能通过AKT/mTOR信号通路调节自噬水平，并抑制NF-κB信号转导通路，从而降低KD冠状动脉内皮细胞炎症因子的表达。