目的:目前,一些普遍存在的妊娠并发症,例如胎儿生长受限、先兆子痫、早产等,影响超过1/6的妊娠,对母体和胎儿的生命健康构成严重威胁。但由于孕妇用药的特殊性,在过去20年中只有少数药物被批准用于孕期病症。纳米医学具有生物利用度高和靶向药物输送等优势,在围产期医学领域表现出巨大潜力。然而,由于纳米材料可能会蓄积于胎盘或通过胎盘屏障对胚胎发育selleckchem VX-765产生影响,限制了其在该领域的研究与应用。聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolRA-mediated pathwayic)acid,PLGA]纳米粒子作为药物载体受到越来越多的关注,但关于PLGA纳米粒子是如何经胎盘转运仍鲜有报道。基于此,本研究利用人绒毛膜癌BeWo b30细胞建立胎盘屏障细胞模型,探讨PLGA纳米粒子在该模型中的转运情况及其可能涉及的机制,为调控纳米粒子跨胎盘转运提供理论基础。方法:(1)PLGA-PEG纳米粒子的制备及表征:采用乳化溶剂蒸发法制备PLGA-PEG纳米粒子,并利用化学反应和物理吸附的方法将异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记在其表面。通过纳米粒度电位仪测定PLGA-PEG纳米粒子的粒径、PDI和Zeta电位,透射电镜观察纳米粒子形貌,并考察其稳定性。(2)胎盘屏障细胞模型的构建:对BeWo b30细胞进行体外培养,通过MTT法绘制细胞生长曲线,并考察在不同接种量下BeWo b30细胞的HCG分泌。将BeWo b30细胞接种于Transwell小室,构建胎盘屏障细胞模型。通过检测跨膜电阻(transepithelial electrical resistance,TEER)、荧光素钠(sodium fluorescein,Na-Flu)表观通透率以及紧密连接蛋白(zona occludens 1,ZO-1)染色等方法,对单层模型的完整性和有效性进行评估。(3)PLGA-PEG纳米粒子及内吞抑制剂对BeWo b30细胞的毒性:通过体外培养BeWo b30细胞,使用MTT法评估在不同浓度梯度下PLGA-PEG纳米粒子及内吞抑制剂对细胞的毒性。(4)通过荧光测定法量化PLGA-PEG纳米粒子的细胞摄取,并研究纳米粒子浓度、温度和孵育时间对摄取的影响,同时利用胎盘屏障细胞模型探究前期制备的PLGA-PEG纳米粒子是否能够穿越该模型。(5)探究内吞抑制剂制霉菌素(nystatin,NY)、菲律宾菌素III(Filipin III)、甲基-β-环糊精(methyl-β-cyclodextrin,MβCD)、氯丙嗪(chlorpromazine,CPZ)、秋水仙素(colchicine,Col)和阿米洛利(amiloride,AMR)对BeWo b30细胞摄取和转运PLGA-PEG纳米粒子的影响,并检测PLGA-PEG纳米粒子和Col对BeWo b30细胞的磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3β(phosphoinositide-3-Kinase/protein kinase B/glycogen synthase kinase-3,PI3K/AKT/GSK3β)通路蛋白表达的影响。结果:(1)我们成功制备了标记有FITC的PLGA-PEG纳米粒子。该纳米粒子的粒径为186.60±7.46 nm,PDI为0.16±0.07,电位为+16.4±3.36 m V。该纳米粒子呈球形,分散性良好,粒径均匀,且具有良好的贮存和稀释稳定性。(2)细胞生长曲线显示,当以1×10~5个/cm~2的细胞密度接种后,在第2～6天,细胞处于增长趋势,与文献报道相符,并以此作为建模的接种密度。HCG分泌实验表明,随着细胞的分裂,HCG分泌量逐渐升高,其中以8万个/孔组HCG升高最为明显。TEER检测结果显示,在接种后的第5天,TEER值符合细胞单层模型的要求并在之后的48 h维持稳定(80Ω·cm~2?TEER?100Ω·cm~2);而Na-Flu表观通透率则在第5天降至极低水平,并在之后的48 h持续减少;ZO-1染色结果显示生长至第6天的细胞单层ZO-1表达完整连续,细胞骨架结构清晰。(3)PLGA-PEG纳米粒子在25～4selleck Bucladesine00μg/m L的浓度范围内对BeWo b30细胞没有明显细胞毒性(P?0.05)。NY(50μg/m L)、Filipin III(1μg/m L)、MβCD(5 m M)、CPZ(7μg/m L)、Col(10μg/m L)和AMR(50μM)对BeWo b30细胞孵育4 h后结果表明没有明显细胞毒性(P?0.05)。(4)BeWo b30细胞对PLGA-PEG纳米粒子的摄取具有浓度/温度/时间依赖性。PLGA-PEG纳米粒子能够跨越胎盘屏障细胞模型,转运量与孵育时间呈正相关。(5)在摄取实验中,Col、AMR和MβCD对PLGA-PEG纳米粒子的摄取抑制率分别为68.13%、60.15%和46.44%,它们对PLGA-PEG纳米粒子的摄取的影响显著(P<0.01或P<0.001),激光共聚焦图像提供了可视化证实。在转运实验中,Col、AMR和MβCD对PLGA-PEG纳米粒子的转运抑制率分别达到37.34%、15.32%和14.26%,它们对PLGA-PEG纳米粒子的转运的影响显著(P<0.001)。免疫蛋白印迹实验显示,在PLGA-PEG纳米粒子刺激下,BeWo b30细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-GSK3β/GSK3β的蛋白表达水平增加,而Col可以抑制BeWo b30细胞对于PLGA-PEG纳米粒子刺激引起的蛋白表达水平增加。结论:制备的PLGA-PEG纳米粒子平均粒径为186.60 nm,呈球形,分散性良好,粒径均匀,且具有良好的稳定性。BeWo b30细胞具有胎盘滋养层细胞的特性,利用其构建的胎盘屏障细胞模型阻滞效果好,连接紧密。BeWo b30细胞摄取PLGA-PEG纳米粒子呈浓度、温度、时间依赖性。PLGA-PEG纳米粒子能够穿过胎盘屏障细胞模型,其进入BeWo b30细胞主要通过巨胞饮作用,其次是小窝蛋白介导的内吞作用,并受到PI3K/Akt/GSK3β信号通路的调节。本研究对于调控制纳米药物的经胎盘转运,提高孕妇用药的安全性具有重要的现实意义。