番茄青枯病是一种由茄劳尔氏菌(Ralstonia,solanacearum)引起的番茄上重要细菌病害。生防假单胞菌(Pseudomonas protegens)FD6可产生多种次生代谢产物,包括抗生素2,4-DAPG、PLT、orfamide、蛋白酶以及嗜铁素等,对番茄灰霉病和桃褐腐病有较好防病作用。为明确FD6对番茄青枯病防病效果,本论文利用平板对峙培养、试管苗实验及盆栽生测实验多种方法证实FD6可有效抑制青枯菌的扩展,在接种病原细菌15 d后防病效果可以达到60%以上,并能显著降低番茄根际和茎基部青枯菌的种群数量。抗生素的产生通常受到多种调控因子的影响,RNA分子伴侣Naporafenib细胞培养Hfq是一种保守的细菌RNA结合蛋白,该蛋白通过与mRNA或小的调控性非编码RNA(sRNA)结合,对革兰氏阴性细菌的蛋白翻译效率和RNA的衰减具有显著调控作用,是重要的细菌转录后调控因子。不同生防细菌中Hfq对基因调控作用有明显差异,从生防细菌FD6的全基因组序列中搜索到261 bp hfq基因,该基因编码86个氨基酸,并具有一个保守的Hfq结构域,包含Sm1、Sm2两个与RNA结合有关的motif。利用同源重组构建hfq基因突变体Mhfq,RT-PCR验证hfq基因突变不存在极性效应。生物学表型结果显示,hfq突变导致细菌生长速率显著降低,运动能力下降,蛋白酶、嗜铁素和HCN产量减少,六型分泌系统(T6SS)功能减弱,而生物膜形成能力增强,但hfq突变不影响细菌的抑菌活性及对番茄青枯病的防病效果。我们同时检测了 Hfq对抗生素合成的影响,HPLC数据显示,Hfq不影响orfamide的合成,但Mhfq中PLT产量上调1.5倍,qRT-PCR结果证明,Mhfq中PLT合成基因pltA、pltB、pltC、pltD、pltE的表达量显著上调,说明Hfq在转录水平负调控PLT产生。此外,Mhfq中2,4-DAPG产量显著下降,甚至几乎不产生。qRT-PCR检测发现,hfq突变后2,4-DAPG合成基因phlABC表达量明显升高,而phlD表达水平显著下调,调控基因phlH表达量升高而phlF表达量也显著降低。以上结果说明,Hfq差异性调控这2种抗生素的合成。通过生物信息学手段对2,4-DAPG合成基因簇mRNA的5’非翻译区搜索Hfq结合基序,推定了Hfq可能结合的靶标mRNAphphlH、phlA、phlD。构建Hfq蛋白的原核表达载体,并进行蛋白表达条件的优化,在大肠杆菌中成功表达了融合His标签的13 kDa Hfq蛋白,其中小部分为可溶性蛋白,大部分以包涵体的形式存在。为提高可溶性蛋PF-02341066白的表达量,对蛋白表达条件进行优化,以0.5 mM IPTG、16℃诱导8h为诱导条件,利用镍亲和填料纯化Hfq蛋白,经过200 mM咪唑洗脱后浓缩得到891 ng/μL的纯蛋白。RNA-EMSA实验证实phlA、phlD与Hfq结合能力强,而phlH需要更高浓度的Hfq蛋白与之结合。综上所述,P.protegens FD6中Hfq对抗生素的合成、生物膜形成、嗜铁素和六型分泌系统具有多效调控作用,且HfMedical officerq通过结合结构基因phlA、phlD和调节基因phlH mRNA5’非翻译区正调控2,4-DAPG的合成,在Hfq调控抗生素合成过程中是否还有其他sRNA参与还有待进一步深入研究。