Thermomonospora umbrina聚羟基脂肪酸酯解聚酶的表达、改造及在胶黏物降解中的应用

以废纸为原料生产再生纸的过程中易出现胶黏物沉积的问题,这会降低纸机设备利用率和纸张质量。国产废纸胶黏物成分以聚丙烯酸酯类化合物为主,而现有酶对聚丙烯酸酯的降解效率低,并且天然没有针对这类聚酯的专用降解酶。本研究挖掘及改造获得具有耐热性能的聚羟基脂肪酸酯解聚酶(Polyhydroxyalkanoate depolymerase,PHAD),并考察其对PHA的典型代表聚羟基丁酸酯(Polyhydroxybutyrate,PHB)、两种胶黏物模式底物聚丙烯酸乙酯(Poly(ethylacrylate),PEA)、聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl methacrylate,PMMA)及实际胶黏物的降解性能,主要研究成果如下:(1)PHAD筛选及Thermomonospora umbrina来源的PHAD(TumPHAD)酶学性质表征。通过数据库筛选、结构模拟及对接分析,选定三个PHA解聚酶作为目的序列,在Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达,其中Shy PHAD和TumPHAD表达情况较好,并在50℃下验证其对PHB、PEA的降解能力。TumPHAD对PHB粉末作用4 h时降解率趋于稳定,为4.2%,重新补加TumPHAD后降解率提高至5.8%,推测该酶热稳定性较差。TumPHAD同样能够降解PEA,反应4 h后,反应体系的浊度降低53.8%,粒径降低29.9%,电位绝对值提高41.5%。同时研究还发现TumPHAD对PHB、PEA降解能力均优于Shy PHAD,因此,选定TumPHAD进行纯化及酶学性质测定。结果表明TumPHAD的比活为15.2 U·mg~(-1),最适温度为40℃,最适p H为8.5,在50℃下的半衰期为20 min,表明TumPHAD热稳定性较差,不能满足工业应用条件。(2)TumPHAD的热稳定性改造。通过分子动力学模拟对TumPHAD结构进行分析,均方根波动数据表明一些范围内的氨基酸残柔性较大,结合Disulfide by Design 2的预测结果,设计构建6个引入二硫键的突变体组合,其中突变体A190C/V240C在50℃的半衰期为7 h,是TumPHAD的21倍,比活为15.4 U·mg~(-1),最适温度由40℃提高至60℃,最适p SAHA NMRH由8.5提高至9.0。进一步分析了突变体A190C/V240C的RMSF,结果表明突变体A190C/V240C在180-200和230-240位范围内的氨基酸残基的柔性低于TumPHAD。(3)突变体A190C/V240C的应用研究。首先考察了突变体A190C/V240C对PHB的降解能力,发现其在50℃下对PHB的4 h降解率为12.0%,是野生型TumPHAD的2.9倍。进一步研究了突变体A190C/V240C在50℃条件下对胶黏物模式底物的降解情况,与本实验室前期获得的Humicola insolens来源角质酶(Hi C,应用性能优于商品酶Optimyze(?)525)相比,突变体A190C/V240C降解PEA体系的浊度和粒径更低,电位绝对值更高;同时还对PMMA有出色的降解能力,48 h时的降解率为20%,且使用扫描电子显微镜观察发现PMMA表面出现大量孔洞,经傅里叶红外光谱检测发现PMMA膜的官能团变化比Hi C处理效果更明显。通过浊度变化情况比较突变体A190C/V240C和Hi C对胶黏物的降解能力,突变体A190C/V240C组的浊度提高了0.440,Hi C组提高了0.361,结果表明突变体A190C/V240Metabolism抑制剂C的降解能力更强Medical Help。最后通过斜面滚球法测定粘黏性变化,在50℃下经突变体A190C/V240C降解后胶黏物的粘黏性降低了50%。