辛味食材往往具有药食同源的特性,常表现一定的临床功效,利用其具有的辛味特征开发活性物质成为近年来的研究热点。桔梗作为临床常用主入肺经的辛味中药,具有宣肺祛痰,利咽排脓的功效。瞬时受体电位A1(TRPA1)能够感受多种有害刺激(如冷热、刺激化合物以及与细胞损伤相关的内源性物质),是传感辛味的经典受体之一,在呼吸道及肺部大量分布,与呼吸道疾病的发生息息相关。具有辛味特征的药食品种及其活性成分可能通过TRPA1的介导发挥其相应功效,因此,本论文利用表达TRPA1蛋白的组织和细胞膜作为电化学生物传感器的传感元件筛选桔梗中的辛味成分,为揭示食源辛味物质的生物作用机制提供一定的理论依据。本论文以表达TRPA1的组织和细胞膜作为传感元件分别构建生物传感器,利用组织传感器使用JT010作为TRPA1特异性激动剂建立了TRPA1激活/抑制模型,测定了A967079、桔梗皂苷元、桔梗皂苷D、桔梗皂苷D_2、桔梗皂苷D_3及去芹菜糖桔梗皂苷D的抑制作用及类型。再根据以上结果使用细胞膜传感器测定了具有抑制作用的化合物对TRPA1的作用强度。TRPA1蛋白与桔梗单体的作用规律与酶促反应动力学相似,因此可以根据酶与底物的作用规律探D-Lin-MC3-DMA体内索分析TRPA1与桔梗中各化学成分的动力学参数,计算得到桔梗单体对TRPA1的抑制常数K_i和激活常数K_a。利用分子对接技术,通过上述实验结果确定TRPA1蛋白的活性位点,通过盲对接模拟分析了各化合物与TRPA1的结合强度与作用位点。主要研究成果如下:(1)将猪舌上皮组织固定在两个核微孔膜中间,通过淀粉-海藻酸钠溶液固定制成“三明治”夹层,构建组织生物传感器。以JT010作为特异性激活剂,建立激活/抑制模型,测定了六种桔梗单体对TRPA1通道的抑制作用。结果显示,A967079是JT010的反竞争性抑更多制剂,桔梗皂苷元、桔梗皂苷D、桔梗皂苷D_2、桔梗皂苷D_3、去芹菜糖桔梗皂苷D是JT010的非竞争性抑制剂,其抑制常数分别为K_(i A967079)=-8.639×10~(-11)mol/L、K_(i桔梗皂苷元)=16.621×10~(-11) mol/L、K_(i桔梗皂苷D)=7.483×10~(-11) mol/L、K_(i桔梗皂苷D2)=medical group chat7.148×10~(-11) mol/L、K_(i桔梗皂苷D3)=5.016×10~(-11) mol/L、K_(i去芹菜糖桔梗皂苷D)=5.601×10~(-11) mol/L,6种抑制剂的抑制强度为:A967079>桔梗皂苷D_3>去芹菜糖桔梗皂苷D>桔梗皂苷D_2>桔梗皂苷D>桔梗皂苷元。(2)用全基因合成和脂质体转染的方法构建了TRPA1蛋白异源表达体系。利用全基因合成将人源TRPA1的基因序列克隆至pc DNA3.1(+)表达载体中,然后将含有TRPA1序列的DNA转化至大肠杆菌感受态细胞从而获得工程菌株。再通过划线培养扩增大肠杆菌从而批量获得含有TRPA1基因的质粒DNA。接下来利用脂质体转染技术将目的质粒转染至HEK293细胞中,加入G418抗生素筛选稳定表达TRPA1蛋白的HEK293细胞株。通过琼脂糖凝胶电泳和Western Blotting实验证实了含TRPA1基因的质粒载体构建成功及TRPA1蛋白在HEK293细胞的细胞膜上稳定表达。构建成功的TRPA1-HEK293细胞株可用于TRPA1的后续研究。(3)通过层层修饰构建表达TRPA1蛋白的细胞膜生物传感器,采用时间电流曲线法(i-t)进行测定,各物质的激活常数分别为K_a _(JT010)=7.935×10~(-19)mol/L、K_(a桔梗皂苷元)=1.002×10~(-17) mol/L、K_(a桔梗皂苷D)=1.306×10~(-16) mol/L、K_(a桔梗皂苷D2)=1.476×10~(-16) mol/L、K_(a桔梗皂苷D3)=5.419×10~(-18) mol/L、K_(a去芹菜糖桔梗皂苷D)=1.539×10~(-15) mol/L,作用强度为JT010>桔梗皂苷D_3>桔梗皂苷元>桔梗皂苷D>桔梗皂苷D_2>去芹菜糖桔梗皂苷D。该细胞膜生物传感器可用于TRPA1通道激活剂的筛选。(4)通过利用分子对接技术建立TRPA1受体-桔梗单体虚拟筛选模型,分析了TRPA1蛋白和化合物单体之间主要的作用力有氢键和范德华力。计算受体与配体之间的结合自由能,预测受体与配体之间亲和力,结合自由能从小到大依次排序为:桔梗皂苷D_3?去芹菜糖桔梗皂苷D?桔梗皂苷元?桔梗皂苷D_2?桔梗皂苷D;桔梗单体与TRPA1蛋白之间的亲和力排序为:桔梗皂苷D_3>去芹菜糖桔梗皂苷D>桔梗皂苷元>桔梗皂苷D_2>桔梗皂苷D。根据上述研究结果,桔梗中的桔梗皂苷元、桔梗皂苷D、桔梗皂苷D_2、桔梗皂苷D_3、去芹菜糖桔梗皂苷D是可以通过TRPA1受体介导发挥作用,并可以抑制TRPA1离子通道的打开。本论文构建的两种类型生物传感器利用表达有TRPA1蛋白的组织和细胞膜作为生物传感器的传感元件可成功用于桔梗辛味物质的筛选。