种子萌发主要受ABA-GA激素稳态的调节。GA水平或信号通路越高,其拮抗ABA的能力越强,刺激种子萌发的促进作用越显著。Ca~(2+)感受器钙调磷酸酶B类蛋白(Calcineurin B-like protein,CBL)可感知Ca~(2+)信号,与其靶蛋白CBL互作蛋白激酶CIPK(CBL-interacting protein kinase)结合,形成CBL-CIPK复合体参与植物发育过程及逆境胁迫响应。本文通过对课题组前期发现的CBLs互作蛋白激酶ZmCIPK32进行了系统的生物信息学、亚细胞定位、相互作用及功能等的深入研究,发现ZmCIPK32可能通过调控GA信号参与种子萌发的调节。为深入阐明CBL-CIPK信号系统与GA信号的交叉作用提供了新的证据及理论支撑。主要研究结果如下:(1)ZmCIPK32是一个典型的CIPK家族成员。序列同源性分析发现,ZmCIPK32与水稻中的Os CIPK32同源性最高,达到96.41%,其次是Os CIPK33与At CIPK3,同源性分别为85.91%、76.13%。蛋白质结构域分析表明:ZmCIPK32具有CIPK家族所特有的N端蛋白激酶结构域和C端NAF结构域。推测该蛋白是一个典型的CIPK家族成员VX-445浓度,因其与水稻Os CIPK32同源性最高,将其命名为ZmCIPK32。(2)GA、PBZ处理增加了ZmCIPK32的表达量。利用GA_3(Gibberlic acid 3)cytotoxic and immunomodulatory effects、PBZ(Paclobutrazol)溶液浸泡玉米种子,RT-q PCR分析ZmCIPK32在玉米种子不同吸涨阶段的表达模式。分析表明:ZmCIPK32在GA_3处理3 h表达量最高,是正常条件下的5.3倍;在PBZ处理6 h表达量最高,是正常条件下的4倍。推测ZmCIPK32可能在种子萌发早期响应赤霉素信号转导,参与种子萌发调控。(3)ABA、Mannitol、Dark增强了ZmCIPK32启动子的活性。为进一步研究ZmCIPK32的功能,利用农杆菌介导的叶盘法和花序侵染法,分析了幼苗发育早期ZmCIPK32启动子的表达特性。结果表明:该启动子为诱导型启动子,在10μM ABA、375 m M Mannitol、黑暗处理下的幼苗中诱导表达,其中,在叶片基部活性更强。(4)ZmCIPK32定位于细胞质膜和细胞质,并与ZmCBL1/9相互作用。在确定ZmCBL1、ZmCBL9蛋白于细胞质膜上表达的前提下,进一步分析了ZmCIPK32蛋白的定位,发现ZmCIPK32定位于细胞膜和细胞质。利用双分子荧光互补技术确认了ZmCIPK32与ZmCBL1、ZmCBL9具有相互作用。为寻找ZmCIPK32蛋白与ZmCBL1、ZmCBL9蛋白互作结构域,将ZmCIPK32蛋白进行截断研selleck HPLC究,酵母双杂交分析表明:NAF结构域是ZmCIPK32与ZmCBL1、ZmCBL9互作的关键结构域。(5)ZmCIPK32促进了ABA、PBZ、Mannitol处理下的拟南芥种子萌发与幼苗早期生长。分析ZmCIPK32对不同逆境处理下拟南芥种子萌发及幼苗早期生长的影响。结果发现:不同浓度的PBZ、Mannatiol、ABA处理下ZmCIPK32都能促进种子萌发;在0.1μM PBZ、200 m M Mannatiol、0.5μM ABA的处理下,对拟南芥种子萌发促进作用最显著,萌发率分别提高了13.35%±1.35、20.2%±2.5、21.7%±3.8。且对幼苗早期生长也有促进作用,根长分别增加了0.19±0.03 cm、0.225±0.075 cm、0.375±0.10 cm。结果表明:ZmCIPK32可促进逆境条件下的种子萌发及幼苗早期生长。(6)ABA、Mannatiol处理增加了ZmCIPK32转基因拟南芥GA_3、GA_4的含量,降低了ABA的含量。利用ESI-HPLC-MS/MS方法,分析了ZmCIPK32对PBZ和Mannatiol处理下拟南芥种子萌发过程中ABA、GA_3、GA_4含量的影响。结果发现:与WT相比,0.1μM PBZ处理下的OE-1、OE-2的ABA含量降低,GA_3与GA_4含量显著升高,尤其是GA_4的含量。并且GA_3/ABA、GA_4/ABA的比值也明显增加。在200 m M Mannatiol处理下也有相似的结果。上述结果表明;ZmCIPK32可能通过调控胁迫条件下的GA、ABA含量,影响GA/ABA的水平,进而促进胁迫下条件下的种子萌发。